高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography,HPLC）也叫高壓液相色譜（highpressureliquidchromatography）、高速液相色譜（highspeedliquidchromatography）、高分離度液相色譜（highresolutionliquidchromatography）等。是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是目前套用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似於氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。HPLC的輸液泵要求輸液量恆定平穩；進樣系統要求進樣便利切換嚴密；由於液體流動相粘度遠遠高於氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小於氣相色譜柱。HPLC套用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領域。
使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最後通過分析比對這些信號來判斷待側物所含有的物質。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的套用於化學和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。
發展歷史
1960年代，由於氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質、核酸等不易氣化的大分子物質，氣相色譜的理論和方法被重新引入經典液相色譜。1960年代末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發了世界上第一台高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數，以高壓驅動流動相，使得經典液相色譜需要數日乃至數月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現代實踐》一書，標誌著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此後的時間裡，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫學、藥物開發與檢測、化工、食品科學、環境監測、商檢和法檢等方面都有廣泛的套用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術、數據處理技術以及色譜理論的發展。
1960年代前，使用的填充粒大於100μm，提高柱效面臨著困境，後來的研究人員便採用微粒固定相來突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯製備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現了高速傳質，為高效液相色譜技術的發展奠定了穩固的基礎。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現。1960年代研製出氣動放大泵、注射泵及低流量往復式柱塞泵，但後者的脈衝信號很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復式雙柱塞恆流泵，解決了這一問題。1970年代後科克蘭製備出全多孔球形矽膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，並逐漸取代了無定形微粒矽膠。之後又製造出的鍵合固定相使柱的穩定性大為提高，多次使用成為可能。1970年後，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年後，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認識到改變流動相的組成事提高選擇性的關鍵。
高效液相色譜的特點
高壓——壓力可達150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。
高速——流速為0.1～10.0mL/min。
高效——塔板數可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：
速度快——通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內即可完成。
解析度高——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，螢光和電化學檢測器可達0.1pg。
色譜柱可反覆使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少，容易回收——樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做製備。
TLC與HPLC都是很重要的方法，TLC簡便快捷，成本低，有些是HPLC不可替代的，比如說展開劑就可以用任何性質強烈的試劑進行分離以便達到預期目的，這些是主要是由於色譜柱的限制的HPLC所不能比擬的，所以TLC在中間體控制，中藥材鑑別和某些中藥材含量測定，以及在合成工藝中的反應程度控制等等都占有不可替代的作用。HPLC專屬性和準確性要高，在某些TLC轉化成HPLC是一種趨勢，從國家的現行標準同以前的標準上就可看出，HPLC的方法套用有很大比例的提高。在一次檢查中，HPLC只能做一個樣，TLC上可以同時展開很多。TLC的成本也較低。由於二者的不同特點，通常在實驗中，先進行TLC，展開後挖出所需部分（帶有矽膠）進行HPLC。或者先用紙層析，之後將紙粉碎，再進行HPLC。
在HPLC中，隨著固定相的發展,有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。HPLC成為解決生化分析問題最有前途的方法。高效液相色譜儀與結構儀器的聯用是一個重要的發展方向。液相色譜-質譜連用技術受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發展很快，如在環境污染分析測定水中的烴類，海水中的不揮發烴類，使環境污染分析得到新的發展。同時氣相色譜-質譜連用技術也得到了廣泛的套用。
