簡要概述
基因探針化學發光檢測儀一種來自基因組中有關的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA，再通過逆轉錄得到的探針，稱為cDNA 探針（cDNa probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內含子序列。此外，還可在體外人工合成鹼基數不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。
探針的製備
進行分子突變需要大量的探針拷貝，後者一般是通過分子克
基因探針為了製備cDNA 探針，首先需分離純化相應mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到，如從造血細胞中製備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板後，在逆轉錄酶的作用下，就可以合成與之互補的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區有完全相同的鹼基順序，但內含子已在加工過程中切除。寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質的胺基酸順序量，也可以按胺基酸的密碼推導出核苷酸序列，並用化學方法合成。
探針的標記
為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標記，以便在結合部位獲得可識別的信號,通常採用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標記法是缺口平移法(nick translation)。首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探針DNA雙鏈上造成缺口，然後再藉助於DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去帶有5’磷酸的核苷酸；同時又利用該酶的5’→3’聚酶活性，使32P標記的互補核苷酸補入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動，同時DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核苷酸所取代。
探針的標記也可以採用隨機引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當後者與單鏈DNA互補結合後，按鹼基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。
DNA探針
螢光間接標記dna探針檢測對於基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質，然後測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分胺基酸序列，然後根據這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細胞和原核細胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用於檢測基因表達時雜交效率要明顯低於cDNA探針。DNA探針（包括cDNA探針）的主要優點有下面三點：①這類探針多克隆在質粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，製備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用於同位素和非同位素標記。
DNA探針可以用來診斷寄生蟲病，現場調查及蟲種鑑定，可用於病毒性肝炎的診斷，遺傳性疾病的診斷，可用於改造變異的基因，可用於檢測飲用水病毒含量。具體方法：用一個特定的DNA片段製成探針，與被測的病毒DNA雜交，從而把病毒檢測出來。與傳統方法相比具有快速、靈敏的特點。傳統的檢測一次，需幾天或幾個星期的時間，精確度不高，而用DNA探針只需一天。據報導，能從1t水中檢測出10個病毒來，精確度大大提高。
RNA探針
高辛標記的rna探針近幾年體外轉錄技術不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉錄系統。該系統主要基於一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進行RNA轉錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉錄生成RNA。這種體外轉錄反應效率很高，在1h內可合成近10μg的RNA產生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標記。該方法能有效地控制探針的長度並可提高標記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列）和反義RNA探針（與mRNA互補），反義RNA又稱cRNA，除可用於反義核酸研究外，還可用於檢測mRNA的表達水平。在這種情況下，因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高几個數量級。RNA探針除可用於檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達時，常常需要觀察該基因的轉錄狀況。在原核表達系統中外源基因不僅進行正向轉錄，有時還存在反向轉錄（即生成反義RNA），這種現象往往是外源基因表達不高的重要原因。另外，在真核系統，某些基因也存在反向轉錄，產生反義RNA，參與自身表達的調控。在這些情況下，要準確測定正向和反向轉錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
探針標記
質粒的酶切分析探針的標記方式有放射性標記和非放射性標記。標記物質有放射性元素（如32P等）和非放射性物質（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸標記同位素，被標記的dNTP本身就帶有磷酸基團，便於標記。特點是比活性高，可達9000Ci/mmol；發射的β射線能量高。用它標記的探針自顯影時間短，靈敏度高。32P的半壽期短，雖使用不方便，但為廢棄物的處理減輕了壓力。非放射性標記法有酶標法和化學物標記法。酶標方法與免疫測定ELISA方法相似，只是被標記的核酸代替了被標記的抗體，事實上被標記的抗體也稱為探針，現有許多商品是生物素、地高辛標記的。血凝素與生物素有非常高的親和性，當血凝素標記上過氧化物酶或鹼性磷酸酶，經雜交反應最終形成探針-生物素-血凝素酶複合物（ABC法），酶催化底物顯色，觀察結果。ABC法底物顯色生成不溶物，以便觀測結果。酶標記法複雜、重複性差，成本高，但便於運輸、保存，靈敏度與放射物標記法相當。
探針標記方法有：①缺口平移標記法。利用的是DNA聚合酶I能修復DNA鏈的功能。該法先由DNaseI在DNA雙鏈上隨機切出切口，然後DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸，同時在3´端修復加入被標記核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、簡便、成本相對較低、比活性相對較高、標記均勻，多用於大分子DNA標記，(>1000bp最好)，但單鏈DNA、RNA不能用該法標記。②隨機引物法。隨機引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物，因此它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應的引物作用。將待標記的DNA探針片斷變性後與隨機引物一起雜交，然後以此雜交的寡聚核苷酸為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I大斷段（KlenowFragment）催化下，合成與探針DNA互補的DNA鏈，當在反應體系中含有a-32P-dNTP時，即形成放射性同位素標記的DNA探針。具有上述優點，可代替缺口平移法。此外大小、單雙DNA均可標記，標記均勻，標記率高，但也不能標記環狀DNA。隨機引物法標記探針一般長400~600bp。③末端標記法（又叫尾標）。利用末端轉移酶可進行“尾標”，尾標適用於寡核苷酸探針標記，寡核苷酸探針多用於核酸“點”突變的檢測，該探針可用核酸合成儀人工合成，克隆出的探針一般較長，特異性好，標記量大，雜交的檢出信號強。
探針合成的注意事項有：①合成探針的長短，一般在20~50個核苷酸之間。合成過長成本高，且易出現聚合酶合成錯誤，雜交時間長，合成太短則特異性下降。②鹼基組成G-C應含40%~60%，一種鹼基連續重複不超過4個，以免非特異性雜交產生。③探針自身序列內應無互補區域，以免產生“髮夾”結構，影響雜交。總之，一個好的探針最終要在實踐中才能加以確認。
實驗套用
探針濃度鑑定將禽流感病毒H9N2亞型毒株核蛋白(NP)基因3′端較為保守的、約350bp的編碼序列通過限制性內切酶Hae¸切割、分離後,用隨機引物法製備Digoxigenin2112dUTP標記探針。測定該探針的濃度為100Lgöml。特異性試驗發現該探針只能與實驗室構建的、含有NP基因的重組載體pGEM2TE2NP和pBacPAK2NP以及A型流感病毒H9N2亞型、H3N2亞型以及H9N3亞型毒株基因組RNA結合出現特異性的顏色反應,而與實驗室常用的載體pGEM2Teasy、pBacPAK2His3、pTARGET和pGEMEX22以及新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒基因組不發生反應。套用該探針檢測含NP基因的重組載體和重組病毒證明該探針是有效的,可用於含禽流感病毒樣品或材料的檢測。
DNA探針原位雜交
1、4—6微米切片，用防脫片膠（多聚賴氨酸）處理過的玻片貼附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鮮二甲苯脫蠟，10minX2（趁熱脫蠟）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空氣乾燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸餾水稀釋，濃度為25μg/ml），37℃消化10—15min
6、棄去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗滌3minX3次逐級酒精脫水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然後空氣乾燥
7、加入20μl探針，加蓋薄膜。（探針用預雜交液稀釋，濃度為5μg/ml）。
8、95℃變性10—12min；立刻置於冰塊上，防止復性。
9、37℃雜交16—20h
10、揭去薄膜，每張切片加入以下雜交後洗滌液：
>用2—3滴2XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗滌3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS緩衝液洗滌，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素標記的抗體工作液，37℃孵育45—60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏鹼性磷酸酶鏈親和素複合物工作液，37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP顯色6—16h，
17、雙蒸水終止反應（37℃10min—2h），雙蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固紅，30秒—5min；
19、雙蒸水浸洗，5minX3次
20、脫水、透明、封片
