角膜粘連蛋白

簡介

蛋粘連白對體外角膜上皮細胞凋亡的保護

經驗交流

觀察層粘連蛋白(LN)對離體角膜上皮細胞存亡的影響,以尋找預防角膜上皮細胞凋亡的途徑。方法套用流式細胞儀(FACStarplus)檢測凋亡細胞的亞2倍體DNA的方法,對基礎培養的、與LN共育的以及阻斷LN受體後的兔角膜上皮細胞的凋亡情況進行了對比觀察及分析。結果基礎培養的第6代角膜上皮細胞出現明顯的細胞凋亡;與LN共育的角膜上皮細胞凋亡不明顯;阻斷LN受體後,角膜上皮細胞出現顯著的凋亡現象。結論LN對離體培養的角膜上皮細胞的凋亡有保護作用
利用培養的角膜上皮行角膜移植以改善眼表,是治療角膜表面疾患的新嘗試。體外能獲得長期存活並增殖的角膜上皮細胞是此方法實施的前提,可是在我們對角膜緣上皮細胞進行離體培養時,歷經幾次細胞傳代培養,上皮細胞的增殖力逐漸減弱,最後停止增殖而死亡。為探索細胞死亡的原因,我們套用基礎培養、與層粘連蛋白(laminin,LN)共育以及阻斷LN受體法,對離體角膜緣上皮細胞的存活情況進行了觀察及對比分析,以尋找預防細胞凋亡的途徑。

具體過程

 1 材料與方法
1.1 角膜上皮細胞培養法
1.1.1 基礎培養法 取新鮮兔眼球無菌處理後,取淺層帶有角膜上皮的角膜緣組織,以質量濃度0.25%胰蛋白酶-0.01mol/L EDTA孵育消化法獲取角膜上皮細胞(1×106/ml),在含有10%小牛血清的F12-DMEM(Gibco,USA)培養液中,5%CO2,37℃,飽和濕度培養箱中培養。48h傳代1次。
1.1.2 與LN共育法 將96孔培養板底塗一層LN液(25μg/cm2),-70℃凍乾後,將角膜上皮細胞(1×106/ml)種於上。5%CO2,37℃,飽和濕度培養箱中培養48h。
1.1.3 阻斷LN受體法 將角膜上皮細胞種植在含有10μg/ml抗-LN單克隆抗(Sigma,USA)培養液中,5%CO2,37℃,培養48h。
1.2 細胞凋亡的流式細胞儀檢測法
用質量濃度0.25%胰蛋白酶、0.01mol/L EDTA消化培養48h後的各組角膜上皮細胞,收集細胞,調細胞濃度在1×106個/ml;取1ml細胞懸液,離心800~1000r/min,10min,棄上清;重懸細胞於100μl的PBS中;慢慢滴注細胞懸液到(事先預冷-20℃)5ml的70%的乙醇中固定;放置4℃中待用。用前離心去除固定液;加PNAase 200μl37℃水浴30min;再加入800μl碘化丙啶(prooidium iodide,PI)染色液,混勻,4℃,避光30min;在FACStarplus流式細胞儀上分析細胞凋亡(亞2倍體DNA)的情況。實驗獲取的數據經SPSS 4.0統計學軟體處理分析。
2 結果分析2.1 離體角膜上皮細胞在基礎條件培養下的細胞凋亡檢測結果 角膜原代上皮細胞被檢測出7.00%±2.23%的凋亡細胞。第1代到第5代各組細胞與原代相比,細胞凋亡率並無明顯變化(P>0.01);從第6代開始,角膜上皮細胞凋亡率為18.74%±3.93%,與原代相比,細胞凋亡率有顯著升高(P<0.01)。
2.2 與LN共育的第6代角膜上皮細胞凋亡率明顯低於基礎條件培養下的同代細胞(P<0.01),見表1。

表1 LN對離體培養的角膜上皮細胞

 表1 LN對離體培養的角膜上皮細胞

凋亡率的影響(±s,n=5)

Tab.1 The effect of laminin on the apoptosis rate of corneal

epithelial cells cultured in vitro(±s,n=5)

 阻斷LN受體後,角膜上皮細胞貼壁障礙,原代細胞即被檢測出30.80%±7.90%的凋亡DNA。見表2。

表2 阻斷LN受體對離體培養的角膜上皮細胞

Tab.1 The effect of anti-laminin receptors on the apoptosis rate

of corneal epithelial cells cultured in vitro(±s,n=5)

 Apoptosis rate(%)tP
Passage 0 (control)6.3±1.7
Passage 0 in anti-LN30.8±7.96.77960.0019

ttest P<0.01

3 討論細胞凋亡是一個非常複雜的生理和病理過程,機體內外多種因素均可影響細胞凋亡的發生[1]。角膜上皮組織在生理狀況下存在著一定數量細胞凋亡,所丟失的細胞由角膜緣幹細胞的增殖來補充,維持著角膜上皮的完整[2]。角膜緣幹細胞在理論上應該是具有無限潛在的增殖能力,可是在我們對角膜緣上皮細胞進行體外培養時,發現在一般培養條件下,第6代角膜緣上皮細胞出現了顯著的細胞凋亡現象,不足10代時,細胞出現了集體“自殺”現象。這與角膜緣上皮細胞在體內的代謝情況相差甚遠,這種離體後細胞的凋亡無疑與體外細胞生長環境的改變相關。
LN是基底膜的特異的和主要的蛋白組成成分,它突出的生物作用就是促進細胞的粘附和運動。近年來,發現LN生物效應遠比目前定義的要複雜得多,雖然現在還不能很明確地定義LN的功能,但是許多研究的確發現LN與眾多的細胞生物現象相關[3]。多年來,在治療角膜上皮疾患中發現:長期不愈的角膜上皮缺損都伴有角膜基底膜的異常及缺失[4]。基底膜中的LN除了促進細胞粘附的重要功能之外,它的成分及空間結構決定著角膜上皮的分裂、增殖及分化[5]。因而,LN應是與上皮細胞存活最為密切的相關因素之一。我們用抗LN抗體完全封閉內源及外源性LN對離體的角膜上皮的作用時發現細胞貼壁障礙,幾乎不增殖,原代細胞就出現大量的細胞凋亡,由此可見LN的缺乏可誘導細胞凋亡的發生。相反,我們用外源性LN來增進培養細胞的粘附及增殖可明顯地減少細胞的凋亡。因此,在預防角膜上皮細胞凋亡的措施中,LN應是不可缺少的重要因素之一。

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