介紹
β-胡蘿蔔素酮化酶(BKT)是雨生紅球藻蝦青素合成途徑中的關鍵酶。根據GenBank中所收錄的雨生紅球藻BKT的cDNA序列設計特異性引物,以高光照處理的雨生紅球藻細胞的總RNA為模板,採用RT-PCR的方法克隆出了β-胡蘿蔔素酮化酶基因(bkt)。序列測定結果表明,bkt全長960bp編碼320個胺基酸。克隆的bkt序列與GenBank收錄的BKT的cDNA(AY603347)序列只相差一個鹼基。並對其編碼的胺基酸進行了二級結構的預測和疏水性分析。同時將所克隆的bkt構建入衣藻葉綠體表達載體p64Dbkt,為基因的進一步表達研究及探索其作用機制奠定了基礎。
摘要
根據已知的β-胡蘿蔔素酮化酶(β-caroteneketolase,BKT)的cDNA序列設計引物，利用長距離PCR擴增獲得了bkt基因的。DNA完整編碼片段及基因組DNA片段，並對這些片斷進行了序列測定。CDNA和基因組DNA比對結果表明該基因至少包括5個內含子，它們的剪下位點皆符合GU-AG規律。在比對結果中同時還發現一個19bp的短序列重複，該重複序列在bkt的cDNA和基因組DNA上都發生了多次重複，推測在BKT的表達調控中可能具有一定功能。另外，在序列比對過程中還發現本實驗所獲得的cDNA和基因組DNA序列與前人報導的。DNA序列之間都存在多處單鹼基差異和19bp的短序列差異。
ThispaperhaddesignedprimersaccordingtothecDNAsequencereportedbyKajiwara,clonedthecDNAandgenomicDNAfragmentsbyLD-PCR,andobtainedtheirentiresequencesbysequencing.ThealignmentinbetweencDNA,genomicDNAandcDNAreportedbyKajiwarashowsthatthisgeneincludesfiveintronsatleastandalltheexon-intronjunctionsconformtoGU-AGspicingrule.Throughalignmenta19bplongshortrepeatunitwasfound,whichexistsincDNAandDNAofbktforseveraltimes.TheymayhavesomefunctionsinBKTexpressionregulation.Thediversitiesfromsinglenucleotidesand19bpshortsequencebetweencDNAsequencereportedbyKajiwaraandDNAsequencesobtainedinthispapersuggestedtheyhavedifferentorigins.
相關介紹
胡蘿蔔素
β-胡蘿蔔素胡蘿蔔素BetaCarotene[編輯本段]發現與分類
1929年，Moore通過實驗發現，缺乏維生素A的大鼠補飼β-胡蘿蔔素後能顯著提高體內維生素A水平，從而證實了胡蘿蔔素能在體內轉化為維生素A，發揮維生素A的作用，所以又稱其為維生素A原。
胡蘿蔔素的化學結構上中央有相同的多烯鏈，根據存在於其兩端的芷香酮環或基團的種類有α，β，γ，δ，ε，西紅柿紅素等許多異構體。β-胡蘿蔔素在胡蘿蔔素中分布最廣，含量最多。在眾多異構體中最具有維生素A生物活性。在綠葉中與葉綠素共同存在，胡蘿蔔的根里也有很多，在氯仿中的最大吸收量為497~466毫微米。β-胡蘿蔔素不溶於水和醇，溶於苯，氯仿，二硫化碳等。α-胡蘿蔔素在綠葉和胡蘿蔔的根里與β-胡蘿蔔素共同存在，含量一般較少。其苯溶液的鏇光度[α]18cd=+385°。在氯仿中的最大吸收量為485-454毫微米。γ-胡蘿蔔素在生物體內的分布則有限。在氯仿中的最大吸收量為508.5,475,446毫微米。[編輯本段]代謝與吸收
維生素A與胡蘿蔔素的吸收過程是不同的。維生素A的吸收為主動吸收，需要能量，吸收速率比胡蘿蔔素快7-30倍。胡蘿蔔素的吸收為物理擴散性，吸收量與攝入量多少相關。胡蘿蔔素的吸收部位在小腸，小腸細胞內含有胡蘿蔔素雙氧化酶，在其作用下進入小腸細胞的胡蘿蔔素被分解為視黃醛或視黃醇。
日糧中的胡蘿蔔素進入並貯存於機體，主要通過以下幾個步驟：
1、日糧中胡蘿蔔素在動物胃腸道中消化酶的作用下，從其蛋白質複合物中分離出來，在十二指腸與其它酯類物質一起經膽汁乳化後形成乳糜微粒；
2、乳糜微粒向腸道吸收細胞刷狀緣靠近以便被攝取，由小腸黏膜上皮細胞吸收；
3、被吸收的胡蘿蔔素在小腸上皮細胞內立即被轉移到細胞的一側，一部分經雙氧酶在中央或一側裂解後轉化為維生素A滿足機體的需要；
4、肝外組織利用酯蛋白脂酶的作用先於肝臟攝取胡蘿蔔素；剩下的部分和乳糜微粒一起釋放進入淋巴和血液，以低密度脂蛋白為載體轉運到肝臟；
5、被肝臟攝入的胡蘿蔔素貯存於肝臟或者分泌入極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中的胡蘿蔔素被肝外組織攝取，並貯存於肝外組織。
影響胡蘿蔔素吸收的因素：
1、脂肪和脂肪酸
胡蘿蔔素是脂溶性的，脂肪對胡蘿蔔素起運輸作用。日糧中脂肪的含量會影響胡蘿蔔素的吸收，日糧中的脂肪經胰酶和膽鹽作用形成膠粒，胡蘿蔔素溶於其中而一同被吸收。脂肪可刺激膽汁分泌乳化脂肪，從而促進類胡蘿蔔素的吸收。研究發現，牛體脂肪中油酸含量與胡蘿蔔素的含量間存在正相關。在灌注液中添加游離脂肪酸極顯著促進了胡蘿蔔素的吸收，而且油酸的促吸收作用最大，添加脂肪酸後血清中維生素A的濃度極顯著提高。游離脂肪酸促進了胡蘿蔔素的吸收。日糧脂肪促進了細胞對胡蘿蔔素的吸收，提高了細胞內胡蘿蔔素斷裂酶的活性，使胡蘿蔔素轉化為維生素A。雖然許多不飽和脂肪酸對胡蘿蔔素的吸收也有促進作用，但比油酸弱，因為在腸黏膜細胞記憶體在一種脂肪酸結合蛋白，不飽和脂肪酸比胡蘿蔔素更易與脂肪酸結合蛋白結合，這種競爭性降低了胡蘿蔔素的吸收。人食用富含多不飽和脂肪酸的向日葵油時，胡蘿蔔素在小腸的吸收高食用富含飽和脂肪酸的牛脂。
2、膽酸鹽
膽汁乳化脂肪，使脂肪變成小的膠粒，易在小腸的液態環境中吸收，從而促進溶解在脂肪中的類胡蘿蔔素的吸收。當胡蘿蔔素溶於膠體溶液，在無膽汁存在時胡蘿蔔素既不能被吸收也不能發生斷裂生成酯，說明膽汁不僅起腸腔助溶作用，而且參與了胡蘿蔔素的吸收、斷裂和酯化的全過程，並且膽汁促進類胡蘿蔔素的吸收無種間特異性。膽汁中起作用的物質是結合性的膽酸和膽鹽，促吸收的最佳濃度為0.04~0.008mol/L，濃度過高反而起抑制作用。
3、維生素A
日糧中維生素A的含量也影響類胡蘿蔔素的吸收。已有研究表明，缺乏維生素A會增加胡蘿蔔素的斷裂。缺乏維生素A時，小腸上皮細胞吸收胡蘿蔔素下降。但儘管小腸黏膜細胞吸收胡蘿蔔素的能力下降，但總的胡蘿蔔素吸收量卻上升，這可能與淋巴吸收有關，這表明維生素A缺乏可導致胡蘿蔔素的淨吸收增加。
4、其它因素
許多研究表明，碳氫類胡蘿蔔素與含氧類胡蘿蔔素如斑蝥黃，黃體素，西紅柿紅素之間存在著拮抗或協同作用，。黃體素阻礙胡蘿蔔素的吸收，但並不影響胡蘿蔔素的斷裂，當黃體素占優勢時，這種阻礙作用非常顯著,各種日糧纖維包括果膠，在日糧中高水平（5%-20%）會影響人體對胡蘿蔔素的利用率，而且果膠的影響作用大於纖維素，瓊脂及穀物糠麩；日糧中蛋白質水平也影響胡蘿蔔素的吸收，蛋白質水平的提高有利於胡蘿蔔素斷裂為視黃醛，從而有利於維持胡蘿蔔素梯度擴散；日糧中粗蛋白質含量充足可提高胡蘿蔔素加雙氧酶的活性，此外，日糧中類胡蘿蔔素及適宜的Fe2+，維生素E和含-SH基的物質如谷胱甘肽，硫醇等，均有利於該酶活性的正常發揮。作用與功能
1、維持皮膚黏膜層的完整性，防止皮膚乾燥，粗糙；
2、構成視覺細胞內的感光物質；
3、促進生長發育，有效促進健康及細胞發育，預防先天不足。促進骨骼及牙齒健康成長；
4、維護生殖功能；
5、維持和促進免疫功能。數據介紹，胡蘿蔔具有預防和抑制肺癌的作用。胡蘿蔔所含的胡蘿蔔素進入人體後，會轉化成維生素A。每一個胡蘿蔔分子可以轉化成2個維生素A分子。[編輯本段]建議與需要
胡蘿蔔素的正常需要量：
1、就一般成年男性而言，1000國際單位即可防止不足。
2、10~15歲少女建議每日攝入量為4600國際單位。
3、16歲以上的女性建議每日攝入量為4200國際單位。
4、成年人每日只需食用約85個檸檬或1/2根胡蘿蔔或1片芒果或1根蘆筍即可滿足需要；
5、孕婦需特別注意其安全用量，以免產生畸形兒。懷孕期間，最初攝取量不建議增加。
6、哺乳期女性，在前6個月中可額外增加2500國際單位；後6個月額外增加2000國際單位。
攝取的注意事項：
1、如每天攝取400國際單位以上的維生素E時，最少也要攝取1000IU的胡蘿蔔素；
2、正在服用口服避孕藥時，必須要減少胡蘿蔔素的用量。
3、一星期之中，三餐里含有大量的動物肝臟、胡蘿蔔、菠菜、番薯、香瓜時，沒有必要再補充胡蘿蔔素；
4、胡蘿蔔素與礦物質油切勿一起服用；
5、胡蘿蔔素與維生素B，維生素D、E、鈣、磷和鋅配合食用時，能充分發揮其功效（必須有鋅才能把貯藏在肝臟里的維生素A釋放出）；
6、胡蘿蔔素也能防止維生素C受到氧化；
7、水果和蔬菜的顏色深淺並非是顯示含維生素A多寡的絕對指標。[編輯本段]缺乏與過量
過量表現
1、急性維生素A中毒：成人一次劑量超過90-~300mg（30-100萬IU），兒童一次劑量超過90mg（30萬IU）即可發生急性中毒，主要表現為嗜睡或過度興奮、頭痛、嘔吐等高顱壓症狀，12~20小時後出現皮膚紅腫，繼而脫皮，以手掌、腳底等厚處最為明顯，數周后方恢復正常。嬰幼兒以高顱壓為主要特徵，囟門未閉者可出現前囟隆起。腦脊液檢查壓力增高，細胞數正常，蛋白質量偏低，糖正常。血漿維生素A水平劇增，可達500μg/L以上（正常成人>=200μg/L）。
2、慢性維生素A中毒：成人每天攝入24~30mg，持續半年；或每天9~12mg，超過8年可引起慢性中毒。嬰幼兒每天攝入15~30mg，超過6個月即可引起慢性中毒。主要表現為胃納減退，體重下降，繼而有皮膚乾燥，脫屑，皸裂，毛髮乾枯，脫髮，齒齦紅腫，唇乾裂和鼻出血等皮膚黏膜損傷現象，以及長骨肌肉連線處疼痛伴腫脹，體檢可見貧血，脾臟腫大。
缺乏症
1、暗適應能力下降，夜盲及乾眼病；
2、黏膜、上皮改變；
3、生長發育受阻；
4、味覺、嗅覺減弱，食慾下降；
5、頭髮枯乾、皮膚粗糙、記憶力減退、心情煩躁及失眠。[編輯本段]富含胡蘿蔔素食品
胡蘿蔔，黃綠蔬菜，蛋類，黃色水果，菠菜，豌豆苗，紅心甜薯，青椒，魚肝油，動物肝臟，牛奶，乳製品，奶油。
含胡蘿蔔素原料前十位（每100克）
螺鏇藻（乾）（38810微克）；辣椒粉（18740微克）；掐不齊（12600微克）；枸杞子（9750微克）；柑杞（9750微克）；豆瓣菜（9550微克）；野莧菜（7510微克）；蒲公英（7350微克）；花椰菜（7210微克）；冬寒菜（6950微克）[編輯本段]需要人群
1、長期對脂肪的吸收不良，如患有消化系統疾病，胃腸部分切除者，往往導致缺乏維生素A。這種情況常常發生在5歲以下的小孩身上，主要是因為維生素A的攝取量不足導致。
2、維生素A對於長期佩帶隱形眼鏡或者長時間注視計算機螢幕的人來說，更是重要的營養素。
3、孕婦及哺乳婦女也很需要維生素A。[編輯本段]β-胡蘿蔔素
β-胡蘿蔔素是一種廣泛存在於綠色和黃色蔬菜，水果中的天然類胡蘿蔔素。β-胡蘿蔔素由4個異戊二烯雙鍵首尾相連而成，屬四萜類化合物，在分子的兩端各有1個β-紫蘿酮環，中心斷裂可產生2個維生素A分子，有多個雙鍵且雙鍵之間共軛。分子具有長的共軛雙鍵生色團，因而具有光吸收的性質，使其顯黃色。β-胡蘿蔔素主要有全反式，9-順式，13-順式及15-順式4種形式。β-胡蘿蔔素有20餘種異構體，不溶於水，微溶於植物油，在脂肪族和芳香族的烴中有中等溶解性，易溶於氯仿，化學性質不穩定，易在光照和加熱時發生氧化反應。胡蘿蔔素化學結構圖
β-胡蘿蔔素可通過化學合成、植物提取和微生物發酵3種方法生產，根據生產方式不同分為化學合成β-胡蘿蔔素和天然β-胡蘿蔔素兩大類，目前大多數是化學品，由於天然β-胡蘿蔔素具有很好的抗染色體畸變，防癌作用以及較強的生理活性，天然β-胡蘿蔔素的價格是化學品的2倍。
β-胡蘿蔔素有維生素A源之稱，是一種重要的人體生理功能活性物質。近年來，有關β-胡蘿蔔素對人體作用的研究異常活躍。大量研究證實，β-胡蘿蔔素的許多生物功能與人類健康有密切關係，其在抗氧化、解毒、抗癌、預防心血管疾病，防治白內障和保護肝臟方面的生理作用已被越來越多地證實並套用於疾病的預防和治療。從前人工合成的β-胡蘿蔔素多套用在食品，化妝品和保健品等領域中。隨著毒理學和分析技術的不斷發展，研究表明：儘管化學法合成的β-胡蘿蔔素純度相對較高，生產成本低，但產品容易摻入少量有毒化學物質，有導致染色體突變和致癌作用，而且與天然β-胡蘿蔔素相比吸收效果太差；而天然β-胡蘿蔔素具有抗癌防癌效果，不存在致癌物質，所以隨著認識的不斷提高，天然提取β-胡蘿蔔素將在市場中占據主動地位。但由於β-胡蘿蔔素的脂溶性質，使其套用範圍受到了很大限制。有些研究通過皂化和乳化的方法增強β-胡蘿蔔素的水溶性，但這一方式時間長，對β-胡蘿蔔的穩定性有較大影響，成本也較高。天然β-胡蘿蔔素的提取，目前多採用的方法中存在的有機溶劑，有毒溶劑的殘留問題一直限制著提取產物的使用，帶來較多的食品安全和環境污染問題。而關於水溶性的β-胡蘿蔔素的提取也有相關的研究報導，但β-胡蘿蔔素水溶性較差，通常在提取時還要藉助酶的作用，所以成本高，套用性差。與常規提取方式比較，超聲提取方法具有簡便，提取率高，操作時間短等特點。因此，把超聲提取法作為醇溶性β-胡蘿蔔素提取的一種新途徑，在這個領域中具有良好的套用前景。
