擬南芥

擬南芥

擬南芥又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。其在植物學中所扮演的角色正仿佛小白鼠在醫學和果蠅在遺傳學中的一樣。是在植物科學,包括遺傳學和植物發育研究中的模式生物之一。我國內蒙、新疆、陝西、甘肅、西藏、山東、江蘇、安徽、湖北、四川、雲南等省區均有分布。

基本信息

研究歷史

在自然界中,擬南芥主要分布於溫帶,集中 在歐洲地區;在東非、亞洲大陸、日本也都有分 布,一般生長在野外乾燥的土壤中。歐洲文明的擴 張把擬南芥帶到了北美和澳洲大陸。歷史上對擬南芥科學研究的記載最早可追溯至l6世紀,由德國學者Thai在德國北部的哈茨山區中首次發現並記錄了 這個物種。19世紀分類學家Heynhold將其命名為 Arabidopsis thaliana。現在人們在世界各地共收集 到750多個擬南芥生態型,這些生態型在形態發 育、生理反應方面存在很大差異。在擬南芥的眾多 生態型中最常用的三種是Landsberg erecta(Ler)、 Columbia(Co1)、Wassilewskija(Ws),其中Co1生態型用於擬南芥的全基因組測序。

在1873年,Braun報導了他在柏林郊外發現的一種擬南芥突變體,這可能是擬南芥研究歷史中所 發表的最早一項在分類學之外的研究工作。他當時所發現的這個突變體極有可能就是植物科學研究領域中為人們所熟知的AGAMOUS(AG)基因的突變體,這個基因是花發育ABC模型中的C類基因。 Meyerowitz實驗室於1990年報導了對AG基因的克 隆。之後,另一個值得注意的工作是Laibach在1907年首次報導的對擬南芥染色體的研究並最終確定了擬南芥具有5條染色體。Laibach於1943年詳細闡述了擬南芥作為模式生物的優點,並在他之後的工作中大力推動了對擬南芥的研究。在Laibach和 其他一些科學家的共同努力下,促成了1965年在德國哥廷根召開的第一屆國際擬南芥會議。現在,這個會議己發展成國際擬南芥研究的一項科學盛事, 每年舉辦一次,2007年將首次在我國首都北京召開。20世紀80年代,分子生物學技術的迅猛發展, 給植物科學研究帶來了巨大的機遇。1986年,Meye-rowitz實驗室首次報導了對擬南芥中一個基因的克隆。同年,Horsch實驗室報導了根癌農桿菌介導的T-DNA對擬南芥進行的遺傳轉化。1988年,Meye-rowitz實驗室發表了擬南芥基因組的首個RFLP圖譜 。在之後的幾年中,相繼報導了T-DNA插入突變基因的克隆、基於基因組圖譜的基因克隆。這些突破使人們逐漸認識到擬南芥作為實驗材料對植物生命進行探索的價值。

科研價值

由於有上述這些優點,所以擬南芥是進行遺傳學研究的好材料,被科學家譽為“植物中的果蠅”。

栽培管理

溫室和生長室中生長

1.1播種和發芽

擬南芥可在非無菌條件下,生長在土壤或人工配製的各種培養基中。作為栽植的容器,可根據各自條件置於花盆或格狀分離的多穴塑膠盤中。常用的混合物有泥炭蘚、營養土、蛭石和珍珠岩等,例如珍珠 岩∶蛭石∶泥炭蘚 =1∶1∶1的混合物,表土、堆肥或腐殖質土∶珍珠岩或蛭石 =1∶1,1∶2或 2∶1的混合物。如果用於營養研究則可以蛭石類惰性物質作培養介質,施以配有營養物質的水溶液。栽培擬南芥的介質均要求有良好的排水性,因此一般混合砂子、蛭石等惰性介質,保持良好的排水,防止過濕引起真菌和昆蟲幼蟲滋生。播種前土壤混合物進行高壓滅菌處理 30min,以殺死可能存在於混合物中的任何害蟲。在把土壤混合物置於花盆或其他容器中後,將整個容器置於水或營養液中,靠毛細管作用浸濕介質,然後將處理洗淨來的種子,用尖頭燒融後的移液管小心移至土表,均勻播下。如果播種量較大,可用濃度為 0.1g/100mL瓊脂或砂子事先均勻混合後播種。種子發芽期間必須保持高濕度,故容器可用塑膠膜復蓋,保持一周左右方可揭去。

將播有種子的容器移至低溫或相應低溫條件下,在 2~4℃下 放置 2~4d,從而於吸脹條件下破除種子休眠,這對新鮮收穫的擬南芥種子尤為必要。對大多數擬南芥品系來說其種子是中度休眠 的,收穫已久的這類生態型的擬南芥種子可免於低溫處理,而有些生態型甚至需長達7d的 低溫 處理。乾種子的低溫處理往往是無效的。

低溫處理後,將盆移至溫室或生長室,在 22℃ 左右發芽,夜溫可比日溫低2℃,用 2000lx的螢光燈給予光照,光周期為18h光 /6h暗(也可24h光照

),在 5d左右可見擬南芥發芽。擬南芥發芽需光,故防止種子被土復蓋。

1.2生長發育條件的控制

擬南芥一般是冬性一年生植物,自然條件下種子在秋 天發芽,幼年期度 過冬天,花分生組織在春季分化,種子在夏季成熟脫落。大多數實驗室栽植的擬南芥品種在發芽後 4周開花,而在 4~6周后採集種子。不同擬南芥生態型其發育進程快慢、開花時間早晚、何時成熟等除了取決於遺傳性以外,也受外界環境條件的影響。

1.2.1光

光對擬南芥生長的影響涉及光強和光周期兩個方面。以光強度說,在生長室中一般最適光的光強度為120~150μmol/(㎡ · s)(1μmol/(㎡· s)=5燭光 =0.217W/m 2 =53.8lx),這可通過螢光燈,配以白熾光來達到。在 夏天溫室中,60%蔭影有助於光強控制和溫度調節,高光強或直接太陽光照射對較老植株可以忍受,而年幼植株避免強光。

擬南芥在連續照光和 長日下開花加快,短日時開花被 阻遏或延遲,這表 明擬南芥開花需要長日照光周期,一般至少12h的光照。在冬季溫室中可補充早晚的光照,以滿足光周期需要,一般給以16h光照,8h暗期為宜。連續光照可促進生殖循環,略微提早開花,但使葉數減少及降低種生成,而較短日照有利於營養生長。

1.2.2溫度

溫室和生長室的溫度應予以控制,最適生長溫度 為25℃ 左右,稍低的溫度也是允許的。當水分供應充足時,植物甚至能在高達34℃ 時生長,但會減少受精。較老的植物能忍受高溫,但保持25℃對整個生長周期是有利的。當種子形成時,生長室溫度宜設 定在25℃,而溫室溫度宜在23℃,夜溫可比日溫低2~4℃為宜。

對於許多遲開花的擬南芥生態型來說,幼苗期要給以 4℃左 右處 理一 個時期(如幾周),以完成春化作用,從而在長日下促進開花。而對於常用的擬南芥生態型 Landsbergerecta和 Columbia則 不需作春化處理就能 開花。 必須注意這裡的低溫春化處理是不同於播種時破除休眠的低溫處理,破除休眠的低溫處理又稱層積處理(stratification)。

1.2.3水分

在種子發芽後的頭幾周里,理想的供水是來自毛細管由下至上的滲水,只有當土壤呈現乾旱時適時灌溉。過量供水會引起土表藻類和真菌的生長。在擬南芥頭兩片真葉開始伸展之前必須避免乾旱,當真葉長出後,灌水頻率可相應減少,如每周一或兩次,而至長角果充實階段必須保證水分供應,以利於種子形成。澆水時最好待90%左右的穴盤或花盆完全乾燥之後進行。

不僅土壤供水狀況影響到擬南芥的生長發育,而且濕度也會影響水分供給。雖然濕度的增加(如 50% ~60%)會大大減少土表乾旱的影響以及發芽著的幼苗脫水危害,但一般說來擬南芥植株,包括幼苗都能忍受低濕度,處在蓮座狀階段的植株可在不同濕度下生長,當長角果進入成熟階段時,較低濕度(如 <50%)是有利的。

1.2.4營養

正常情況下只要配置合適的土壤混合物,就並非必須供給營養物質,但是貧瘠的營養狀況會降低植株高度,使它提早開花,並使種子著生減少。在生長發育的後期階段補充營養物質將會增 加種子著生,並產生較健壯的植 株。當植株呈現出輕微淡綠色時,表明營養供給不 足,則應立即施以營養物質,正常健壯的擬南芥植株是亮暗綠色的。

1.2.5防止雜交

擬南芥是自交授粉的,為了保持擬南芥品系的純化,必須防止溫室或生長室中各品系之間的雜交。為此可根 據各自實驗室條件進行設定。例如,保持生長環境的清潔,從而防止經昆蟲載體而導致的雜交機會。栽植時注意各品系種植之間的距離(如 20cm),從而防止來自不同品系的花互相接觸。在長成植株後,可採取適當措施,防止植株倒伏,以致互相接觸。

無菌培養

擬南芥之所以作為模式植物,其中一個原因 在於可以在培養皿滅菌條件下進行突變體篩選。此外,在許多擬南芥研究方面也需要做無菌培養。無菌培養在擬南芥研究中的套用可歸納為以下幾方面:

(1)有利於突變體篩選 突變體篩選是遺傳和分子研究中十分重 要的手段,用無菌培養來篩選突變體有許多有利之處。首先,對大量擬南芥誘變處理的種子很容易進行生活力記錄。其次,生長在培養皿中的植物可在人工控制的條件下穩定生長,以致使實驗設計得以實現,這種突變體篩選方法十分類似於微生物突變體篩選的操作。例如對一些特殊化合物、除草劑、生長調節劑的敏感性可在同一野生型生長阻遏的背景下進行篩選,而如果在土壤條件下對這些化合物進行測試,則很難達到一致的生長 條件,會受到各種因 素影響。再次,無菌培養下培養皿中的篩選還可在下一代同樣條件下重新測試和進行遺傳分析。

(2)在分子水平分析時,常需經基因工程的方法 取得轉 基因植物,而轉基因植物獲得過程中,常採用抗生素篩選等手段,這就必須將 抗生素置於培養基中,在無菌條件下,使轉化有外源基因的個體存活,而淘汰未轉化的組織。

(3)一些實驗操作過程中,為達到某種目的,必須進行無菌培養,例如在用無菌或無真菌的組織進行組織培養,種子發芽測試等。

(4)一些突變體由於缺少了或降低了對生長調節劑的敏感性,或 者缺少了特殊代謝途徑中的某個基因,而 生長十分弱時,必須在特殊培養基上發 芽和生長,然後才轉入土壤中繼續生長。

2.1無菌培養的培養基組成

最普遍的培養基是1倍或0.5倍濃度MS培養基,其中加入瓊脂達 0.6% ~0.8%的濃度,可另加蔗糖至 0% ~3%。也有實驗採用 GamborgB5培養基。以下列出一種培養基配方:

培養基組成最終濃度

MS基本培養基鹽類

4.4mg/mL

蔗糖 10mg/mL

肌醇 100μg/mL

硫胺素 1.0μg/mL

吡哆醇0.5μg/mL

煙酸 0.5μg/mL

MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸] 0.5mg/mL

在上述配製溶液中,加入 1mol/LKOH調 pH至 5.7,在加入適量瓊脂或蔗糖後,滅菌,貯存。當需鋪平板時,將貯藏培養基置於微波爐中熔化,即可將其倒至培養皿中。0.8%瓊脂濃度有利於在不傷根的情況下取出培養的小植株,並移植至土壤。蔗糖用作碳源,有利幼苗茁壯生長,但對只需短時間發芽生長的處理可免去蔗糖成分。

2.2種子滅菌和播種

種子表面滅菌可採用漂白劑、乙醇等,另可附加 SDS,TritonX-100等。例如,將擬南芥種子用含 0.001% ~0.2% SDS的 50%漂白劑處理 10min,或 者將種子在 50%乙醇中浸潤1min再用漂白粉處理。其中SDS也可用 0.1% TritonX-100代替,最終用無菌水淋洗晾乾。如果滅菌過程不採用漂白粉,可將種子在50%乙醇和 0.5% Triton中放置 3min,再用 95%乙醇淋洗,並令其快速風乾。

病蟲害及其防治

作為模式植物栽培時,為了使植株正常生長,培養出有代表性的群體以及潛在的新突變體在早期篩選過程中不致因病蟲害侵襲而使 表型丟失,因此必須注意病蟲害防治。只要採取適當的措施,溫室或生長室的病蟲害是可以預防的。病蟲害可能來自土壤,種子或操作人員本身。防治的原則應以防為主,殺滅為輔。最積極的措施是保持培養環境的清潔。

常見擬南芥病蟲害及一般症狀

1.蟲害

1.1蚜蟲(aphid)

蚜蟲聚集在葉和花 莖上,在莖、葉上分泌密 露,咬食幼小組織致使葉扭曲,嚴重時可引起萎蔫甚至死亡。

1.2薊馬(thrip)

葉上呈現銀色或白色斑點,此薊馬科害蟲在花序上積聚,並使受精受阻。

1.3蘑菇蠅(mushroom fly)

在地上部未有明顯傷害情況下植株長勢弱,葉變黃,在根組織上可見到灰白的蛆,蛆在根上覓食。成年蠅聚集在植株周圍,有時以蠅斑呈現。

1.4紅蜘蛛(redspidermite)

在乾、熱條件下易侵染,葉被造成銀色斑點,嚴重時植株變黃,萎蔫。葉下表面被細白絲線懸浮的白粉蒙蓋。

1.5白蠅(whitefly)

在葉下表面呈現,成 蟲是 小白蠅。若 蟲為淺綠色。它通過吸食汁液侵害植物,侵染導致植株長勢減弱,萎蔫,死亡。

2.病害

2.1白粉病(powderymildew)

在葉花莖、長角果上呈現白粉斑,嚴重時會造成植株萎蔫,死亡。

2.2灰霉病(botrytis)

灰色毛狀黴菌呈現在植株表面,葉隨之腐爛,有時可能伴隨物質的降解。

擬南芥研究的一些重要發現

在植物形態建成研究中,經典的例子是花發育的ABC模型。在結構上,擬南芥的花與大多數開花植物相似,由四輪基本的花器官組成:從外向里分別為花萼、花瓣、雄蕊 及雌蕊。ABC模型中的A、B、C分別指的是控制不同花器官發育的三大類基因,其中A類基因決定了花萼的特徵;A類+B類基因共同作用決定了花瓣特徵;B類+C類基因共同作用決定了雄蕊特徵;C類基因單獨作用決定了雌蕊心皮的特徵,同時也終止花器官在第四輪形成之後繼續分化(A)。在野生型花器官中,這三類基因的表達產物大體按照它們所各自決定的花器官位置,分布於相應的區域。當其中某個基因發生突變之後,它所控制的區域則會發育出其他類型的花器官。例如,在B類基因的突變體中(B類基因功能消失),第二輪的花瓣 區域由於只受到A類基因的調控,會發育出與第一輪相同的花萼,第三輪的雄蕊也會相應地轉化成第四輪的心皮組織(雌蕊的組成部分)(B)。A、B、C三大類基因都編碼轉錄因子,在花原基的發育過程中會由外到內被逐個激活,從而確保正確的 花器官在準確的時期出現。擬南芥花發育中所使用的這套機制與動物發育中基因表達系統類似。在果蠅中,不同的Hox(homeobox)轉錄因子控制著不同部位的發育,它們也類似ABC模型,利用重疊的基因表達區域形成新的器官。

擬南芥擬南芥

除了在花發育中的發現外,近十年來,植物科學家們利用擬南芥模式系統,對植物不同組織和器官的發育開展了類似的研究。通過大量擬南芥突變體的分析,科學家們對植物根、莖、葉、花、胚 胎和種子的發育,對植物抗病性和抗逆性機理,以及對各種生命活動有關的激素、光和環境因子引起的信號傳導過程等進行了深入的研究,極大豐富了人類對於植物生命活動內在機理的認識。

microRNA(miRNA)是擬南芥研究中近幾年來最值得注意的熱點之一。miRNA是高等真核生物中一類非翻譯RNA,由基因組編碼。miRNA前體的轉錄過程與普通基因mRNA的轉錄過程基本類似。不同的是,初始miRNA轉錄本(pri-miRNA)為“髮夾”結構,然後通過不同酶的修飾最終形成“成熟”miRNA。成熟miRNA僅含有19~23個鹼基核苷酸,但是這些寡聚核苷酸卻可以通過鹼基配對與一些基因的mRNA結合,在一些酶的參與下破壞與之結合的mRNA或者干擾mRNA的正常翻譯。miRNA 最早於1993年線上蟲中發現,在擬南芥中,大多數已經發現的miRNA都參與植物重要的生命活動,例如,植物的形態建成,RNA誘導的基因沉 默以及植物對於逆境的適應性等。

近年來,通過對擬南芥的研究,科學家們獲得了關於miRNA生物合成過程的新認識。在動物中已經報導了由RNA酶III結構域的Drosha蛋白和由 RNA雙鏈結合結構域的Pasha蛋白參與pri-miRNA的加工。擬南芥中也發現了Drosha的同源蛋白DCL1 (含RNA酶III結構域)和Pasha的同源蛋白HYLI(RNA 雙鏈結合結構域)。最近的研究表明,擬南芥中除了DCL1和HYL1之外,參與加工miRNA初始 轉錄本的還有另一個必需蛋白SERRATE(SE)。SE編碼一個含“鋅指”結構域的蛋白,在動物的pri-miRNA加工過程中尚未發現。除此之外,在擬南芥miRNA的生物合成途徑中還發現另一個重要的蛋白HENl,它的主要功能是使已經剪下成19~23 個鹼基的miRNA末端的核糖被甲基化。一般認為甲基化是為了防止rniRNA的末端被其他酶所識別,從而保證了rniRNA在細胞特定位置的穩定性。以上這兩項研究為完整認識高等生物中(包括動物和植物中)的miRNA生物合成過程提供了有價值的信息。

在擬南芥中除了干擾一些重要基因的mRNA的miRNA之外,最近還發現了另一類新的小分子RNA,稱之為trans-acting siRNA(ta-siRNA)。這種小分子RNA目前在動物中還沒有相關的報導。ta-siRNA像miRNA那樣來自於基因組中特定基因的 轉錄。與miRNA不同,ta—siRNA的前體就如同普通的mRNA,不像miRNA的前體那樣形成“髮夾”結構,只是這種ta—siRNA的轉錄本不翻譯蛋白,而只能在一些酶的參與下被加工形成小分子RNA。加 工後的ta-siRNA會像rniRNA那樣作用於與之鹼基配 對的靶基因mRNA。目前,在擬南芥中總共發現了 5個編碼ta-siRNA的基因——a、b、TASlc、TAS2、TAS3等,其中TAS3產生的ta-siRNA 參與葉片極性發育,並且調節植物營養生長階段時間的長短。

擬南芥菜的植物生物學全方位功能研究及其在農業生產中的開發套用。 大會將分為以下各專題:

1. 植物發育(Development)

2. 植物信號轉導(Signal transduction)

3. 遺傳學(Genetics)

4.基因組學(Genomics)

5. 植物對環境的應答(Plant responses to environment)

6. 植物與微生物的反應(Plant responses to microbials)

7. 植物細胞生物學(Plant cell biology)

8. 代謝和生物能源(Metabolism/Bioenergy)

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