切口平移法

DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連線到切口的3'羥基末端。 (b) (c)

雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。
切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連線到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由於在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500個核苷酸。
切口平移反應受幾種因素的影響:
(a) 產物的比活性取決於[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。
(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli
DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小。
(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化後的DNA。