核酸的人工合成

以核苷或單核苷酸為原料並且不依靠任何天然模板或引物，採用有機合成反應或酶促合成反應進行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。在核酸的理論研究和實際套用上人工合成是一個重要的手段。1957～1965年H.G.科拉納等人設計併合成了由一種、兩種或3種脫氧核苷酸組成的重複順序的脫氧寡核苷酸片段，並以此為模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶進一步複製和轉錄，得到了具有對應的互補順序的長鏈人工信使核糖核酸(mRNA)，再用這種人工mRNA在無細胞體系中進行蛋白質合成。通過分析這樣得到的多肽產物的胺基酸順序和與模板中核苷酸順序的對應關係破譯了遺傳密碼。

核酸的人工合成

正文

　
　人工合成基因促進了基因工程的發展。如1977年,坂倉等人首先合成了生長激素釋放抑制因子的基因，並使之在大腸桿菌中實現了表達，得到了在大腸桿菌中原來並不存在的活性肽（十四肽）。此後，一系列多肽和蛋白質基因，如胰島素、干擾素和生長激素等的基因相繼被合成，並得到了很好的表達，使得這些原來只能從動物組織中得到的含量不多的蛋白質能以細菌發酵的辦法大量生產。
1981年中國生化學家王德寶等完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的全合成工作，這是第一個人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。
核酸合成包括化學合成和酶促合成兩個方面。
化學合成　以核苷或單核苷酸為原料，完全用有機化學方法來合成核酸。由於核苷酸是一個多官能團的化合物，因此,在化學合成中,必須將不希望發生反應的基團保護起來。例如想將圖1 中甲、乙兩個3′-核苷酸連線起來生成3′-5′-磷酸二酯鍵,並且要符合甲在乙前的順序,如果不將某些基團保護起來，勢必會發生許多不需要的副反應干擾產物的生成。在這裡,只希望核苷酸甲的3′位上的磷酸基團與核苷酸乙的5′位上的羥基反應,因此甲的2′和5′-羥基,乙的2′-羥基和3′磷酸基團都必須保護起來,以排除不必要的副反應。又如圖2 所示由核苷酸甲和核苷乙合成二核苷一磷酸的反應式中，R1、R2、R3和R4都是保護基,其作用是使核苷酸甲的3′磷酸基能專一的只同核苷乙的5′羥基反應生成甲-乙順序的3′-5′-磷酸二酯鍵。此外，在核苷酸的鹼基上如果有氨基（如胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤的環外氨基）也必須加以保護。在DNA合成中,由於脫氧核苷的2′位上是氫而不是羥基,就不必保護。

核酸的人工合成

核酸的人工合成

除了用圖2中的兩種原料外,也可以將核苷乙改為5′-核苷酸，並把2′和3′位上的羥基保護起來，同2′和5′羥基被保護的核苷甲上的3′羥基反應（圖3）。

核酸的人工合成

由於這兩個反應是通過磷酸單酯和羥基縮合生成3′-5′磷酸二酯，故稱為磷酸二酯（合成）法。
在磷酸二酯法中，由於產物為磷酸二酯，磷酸上所剩下的OH基團，雖然化學活性較小,但也能發生反應,因此,當合成的寡核苷酸鏈逐漸增長時,由這個磷酸OH基團所帶來的副反應也愈益嚴重，使合成產率急劇下降。目前這個方法已基本上被淘汰，改進的辦法之一是採用適當的保護基把磷酸上的OH基團也保護起來，再進行連線反應。即如圖4 所表示的那樣，用甲核苷3′-磷酸二酯（用R5保護磷酸上的OH基團）同乙核苷的5′-羥基反應生成磷酸三酯型的產物，這個方法稱為磷酸三酯法。

核酸的人工合成

另一個改進的辦法是採用圖5 所示的路線，以保護的亞磷醯胺單體為原料，經1-H-四氮唑活化後與羥基組分連線，先生成亞磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，稱為亞磷醯胺法或亞磷酸三酯法。

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在磷酸三酯法和亞磷酸三酯法基礎上發展起來的固相合成法,其基本原理是將要合成的寡核苷酸鏈的3′末端核苷先固定在一個不溶性的高分子上面，然後再從此末端核苷開始，逐步接長，接長的鏈始終被固定在載體上，過量的未反應物和分解產物則通過過濾或洗滌除去，每接長一個經歷一次循環。當整個鏈的增長達到所需要的長度後，再將寡核苷酸鏈從固相載體上切落下來並脫去保護基，經過分離純化得到所需要的最後產物。
固相合成不僅可以縮短合成的時間,提高總產率,並且由於每一個縮合循環都經過同樣的操作步驟，因此可以採用自動控制手段。目前已經設計出多種型號的全自動或半自動的合成機器，其每一次的連線產率達到97～99％，最快的每輪循環不到10分鐘，最長的合成片段可到100核苷酸以上。
酶促合成　通過酶促反應可以把化學合成的小片段連線成為大片段，或是從已經合成的單鏈製成雙鏈，它可以加快合成工作的進展，使人工合成核酸大分子的目標得以順利地實現。
大腸桿菌DNA連線酶和T4噬菌體DNA連線酶是兩種經常使用的DNA連線酶。大腸桿菌的DNA連線酶要求兩個被連線片段的末端上有幾個互補的鹼基（稱為粘性末端），否則就不能連線(圖6)。

核酸的人工合成

T4DNA連線酶不但可以連線帶有粘性末端的DNA片段，也可以連線平頭的末端（圖7）。

核酸的人工合成

已知有幾種酶可以用於 RNA合成。多核苷酸磷酸化酶能夠以2′位上保護的核苷二磷酸為底物,在一個三核苷二磷酸的引物片段上接長一個核苷酸，以得到的產物作引物,經過同樣循環,可以合成更長一些的RNA片段。利用核糖核酸酶N1、T1、U2和牛胰核糖核酸酶A等核酸水解酶的逆反應，在適當條件下,也可以合成某些RNA小片段。T4噬菌體感染大腸桿菌後產生的T4RNA連線酶,是RNA大分子合成中最重要的一個工具酶,它能催化帶有5′-磷酸的RNA片段（又稱供體）同另一個帶有3′-羥基的RNA片段（又稱受體）之間的單鏈連線反應，不僅能夠合成RNA小片段，也能合成RNA大片段。
中國科學工作者在人工合成轉移核糖核酸的工作中曾經對RNA的酶促合成反應，特別是對有關T4RNA連線酶催化合成RNA的最適反應條件進行過深入的研究,他們在化學合成或化學加酶促合成的 RNA小片段的基礎上利用T4RNA連線酶先合成得到6個較大的片段，然後再進一步連線成兩個半分子並最後實現酵母丙氨酸轉移核糖核酸的全合成。圖8是酵母丙氨酸轉移核糖核酸的結構和 6個大片段及兩個半分子的合成分段位置。

核酸的人工合成

參考書目
　王德寶、祁國榮：《核酸　結構、功能與合成》、科學出版社，北京，1986。
　王德寶等：酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工全合成，《中國科學（B輯）》，1983/5，北京。

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