研究進展
1、錯配修復基因hMLH1的發現
錯配修復基因是糾正鹼基錯配的主要因子，它不同於其它抑制基因對細胞的無序增長具有直接的作用，而是通過修復DNA複製過程中產生的錯誤，維持基因組的穩定性，避免突變，間接抑制腫瘤的發生。目前已發現人類的MMR系統含有9個錯配修復基因，其中以hMLH1和hMSH2功能最為重要，hMSH2和hMLH1基因突變占所有檢測到突變的90 %以上。hMLH1是繼Fishel等在1993年在HNPCC細胞中首先分離出與大腸桿菌mutS同源的hMSH2之後的MMR家族中的又一個錯配基因的發現。該基因定位於3p21，是細菌錯配修復基因mutl的同源物，與大約30％的HNPCC有關，hMLH1的cDNA全長2484 hp，編碼長度為2268bp的開讀框架，hMLH1蛋白由756個胺基酸殘基組成，與酵母錯配修復基因hMLH1比較有41％的同源性，hMLH1在結直腸癌中可能起著一種看家基因的作用。在部分HNPCC患者中hMLH1基因在第4l位密碼子有一個C—T 突變，使相應的胺基酸殘基由絲氨酸變成苯丙氨酸。另外，在HNPCC的患者中還檢測到了第578至632位密碼子之間的雜合性缺失及從第727位密碼子的第一個核苷酸開始的4個核苷酸的缺失，在另外一些病例的第519位密碼子則存在一個T的插入，造成hMLH1蛋白產物的羧基端238個胺基酸殘基的缺失。另外，張曉梅等在結直腸癌患者的體細胞中發現了位於hMLH1基因第ll5l位鹼基T—A的雜合型顛換，導致其第384位編碼胺基酸由纈氨酸(Va1)突變為天冬氨酸(Asp)，隨後的研究結果表明，Va1384Asp作為東亞人hMLH1基因上的一個多態位點。2、錯配修復基因的功能和作用機制
hMLH1和其它的MMR基因的基本功能一樣，是消除DNA複製過程中由於DNA 聚合酶滑移而引起鹼基-鹼基錯配和插入-缺失突環的形成。鹼基-鹼基錯配損害主要影響非重複的DNA，從而導致單鹼基的錯配，表現為DNA複製錯誤(replication errors,RER)，而插入-缺失環的形成會影響DNA重複序列，引起短重複序列的插入或缺失，亦可表現為微衛星的插入或缺失，從而表現為微衛星不穩定(microsatellite instablility,MSI)性。DNA複製過程中，在複製一個重複單位後，子鏈與模板鏈分離，然後與下一個或下幾個重複單位重新結合，使一個或幾個重複單位形成“環凸”區域。正常情況下該結構可被MMR系統所校正，但MMR系統失常時，子鏈DNA如繼續延伸即可引起突變。目前MMR基因的作用機制仍不很清楚，推測可能是人類MMR基因編碼的錯配修復蛋白可相互作用形成一種多聚複合物，參與細胞錯配修復反應。hMLH1和hPMS2蛋白形成hMutL α二聚體，與結合到DNA鏈上的hMutS形成一種暫時性的複合物，從而啟動錯配修復，在DNA聚合酶Ⅲ、DNA連線酶、單鏈結合蛋白、外切核酸酶及增殖細胞核抗原等的參與下，切除含有錯配鹼基的一段DNA鏈，然後重新合成一段DNA鏈，這樣就修復了含錯配鹼基的DNA核苷酸鏈。結直腸桿菌細胞中的這種修復機制是通過錯配修復系統識別鹼基正確的母鏈和錯配的子鏈來進行修復反應的，即利用兩條鏈的甲基化狀態的不同來進行區別的。一般DNA複製後，子鏈會在甲基化酶的作用下被甲基化，但在子鏈合成後的很短時間內，其不會被甲基化，這樣錯配修復系統能區分甲基化的母鏈和非甲基化的子鏈，這種修復機制被認為是甲基導向錯配修復機制(methyl directed mismatch repair)，人類錯配修復系統也需這種作用。3、MMR基因hMLH1的檢測
人們使用各種不同的方法對包括散發性結直腸癌在內的癌症病人的hMLH1基因改變及其引起的相關改變進行檢測，目前常用的方法如下：正常或腫瘤組織的微衛星序列通過PCR擴增，聚丙烯凝膠電泳分離或者通過螢光PCR自動生成以檢測腫瘤組織的微衛星不穩定性；通過異源雙鏈分析檢測hMLH1功能；hMLH1突變的直接檢測包括，基於DNA 的檢測技術如PCR、SSCP、DGGE，基因組DNA測序；基於RNA的檢測技術如RT-PCR、cDNA測序等方法。另外較常用的體外耦聯的轉錄翻譯反應技術(IVTT)；通過甲基化特異性PCR，檢測hMLH1基因甲基化狀態，這些方法各有其優缺點，微衛星不穩定性可以間接反映錯配修復系統是否失活，較為簡單、可靠，但只能間接反應錯配修復系統的總體情況，而不能直接反映錯配修復系統是如何失活的，而且MSI與其它多種因素都有關係，單單MSI不能肯定說明MMR系統的改變；異源雙鏈分析用於檢測基因功能，因此只能檢測基因的功能，而不能反映基因到底是如何發生變化的；SSCP或DGGE可以檢測MMR基因突變情況，但每次反應只能檢出檢測基因的個別外顯子；IVTT法用於檢測移碼突變，hMLH1基因有40％為移碼突變，該方法可以快捷、有效、可靠地檢出基因突變造成的截短型蛋白質，但無法檢測其他的突變，如錯義突變、部分移碼突變等不造成蛋白質截短的MMR基因突變；檢測MMR基因甲基化狀態可以反映MMR基因甲基化情況，對於腫瘤非遺傳機制的研究可以提供一個依據，但甲基化狀態的研究反映的只是MMR基因發生改變的可能的一小部分機制而已。因此，在對MMR基因進行研究時，我們有必要時以上技術進行篩選，選其中的幾個方法進行實驗，使它們能取長不短。1993年Ionow和Aaltonen等發現，在幾乎所有的HNPCC腫瘤和約12%~15%的散發性CRC中存在著微衛星上的突變，稱作微衛星不穩定性(microsatelliteinstability,MSI)，由此提出了另一條嶄新的途徑——錯配修復途徑。它的基本原理是MMR基因保證了DNA複製的高度保真，一旦MMR基因發生突變或啟動子甲基化引起錯配修復基因失活，導致機體錯配修復功能的降低，進而導致整個基因組的不穩定，MMR功能缺陷的表現型是高度的微衛星不穩定(MSIH)，又稱之為複製錯誤(repliationerror,RER)陽性，從而使某些癌基因和抑癌基因的突變在體內得到快速聚集，腫瘤由此發生，表現為腫瘤細胞的DNA多為二倍體或近二倍體的含量，在此途徑中，hMLH1和hMSH2這兩個MMR基因起主要作用。RER陽性的散發性CRC與RER陰性者相比，具有不同的臨床病理、分子生物學特徵，表現為：發病年齡較輕；多位於近端結腸，且易伴發腸內或腸外其他器官的多發性腫瘤；對某些化療藥物(如5-FU、順鉑等)有原發性耐藥；腫瘤細胞DNA多為二倍體或近二倍體；低分化腺癌、黏液腺癌及印戒細胞癌多見，但較少發生淋巴結轉移，生物學行為較好。近年研究發現，hMLH1蛋白的表達變化結果可以很好地預示MMR功能缺陷的存在。
DNA錯配修復基因(DNA mismatch repair gene)首先在細菌和酵母中發現，在人類基因組中也存在類似物。這種基因的突變在人類遺傳性非息肉型結直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和散發性結直腸癌（sporadic Col orectal Cancer,SCRC）的發病過程中起重要作用。DNA錯配修復基因既非癌基因，也非抑癌基因，是另一類腫瘤相關基因，這是繼癌基因與抑癌基因之後，在腫瘤發病的分子機制方面的又一重大進展。錯配修復基因（MMR）是一類和人類的錯配修復反應有關的基因，包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。其中，又以hMSH2為尤為重要。
與結直腸癌的關係
1、hMSH2基因結構和功能
hMSH2是第一個被分離到的人類錯配修復基因，該基因與細菌的Mut S同源，位於2p21～22，其基因DNA全長約79kb(不包括啟動子)，cDNA全長3111 bp，有16個外顯子，並含有2727 bp的開放閱讀框架，翻譯後編碼一種由909個胺基酸組成的蛋白質；hMSH2蛋白在錯配修復過程中通過核苷酸聚合酶而起作用，它失活後可引起複製錯誤的累積，從而引起突變表型。Kolodner等發現有一種與細菌MutS基因同源的人類錯配修復基因hMSH2，位於染色體2，D2S123標誌物的附近。將突變的hMSH2克隆入E.coli可以引起基因標誌物突變率的增加。最後，他們表明26名散發的結直腸癌患者中的7名包含 (CA)n二重重複複製，且該7位患者中的2位有hMSH2基因突變。核苷酸錯配發生於三種情況：即DNA的物理損傷、DNA複製過程中核苷酸的錯誤摻入以及基因重組。DNA聚合酶偶爾能催化不能與模板形成氫鍵的錯誤鹼基的摻入，這種複製錯誤通常由聚合酶3′～5′的校對功能立即予以糾正，再開始下一個核苷酸的聚合反應。在某些特殊條件下，DNA聚合酶將極少的錯誤鹼基遺留在DNA鏈上而未予以糾正，因此，DNA的錯誤修復必須有MMRS參與，它在修復過程中高度特異的識別錯配鹼基，並在此基礎上對其進行雙向切出,此時同樣也依賴於DNA複製時模板鏈和新生鏈的甲基化程度的差異。錯配修復反應既可修復DNA複製過程中出現的鹼基錯配，又可消除由於含簡單重複序列的同源序列間遺傳重組出現的不配對序列，這樣可有效的防止DNA複製差錯的產生。
在DNA錯配修復中,hMSH2蛋白質首先與G-T結合(G-T Binding Protein,GTBP)形成一種稱為hMSH2 α二聚體複合物，並結合到DNA鹼基錯配區，然後與hMSH1和hPSH2基因形成的二聚體hMut L α結合，其中異源二聚體hMutL α起到識別帶有缺口的新生DNA鏈的作用。hMut L α與hMut S α結合到DNA錯配區後，即可激活與Mut H蛋白有關的GATC核酸內切酶，這種酶可切出未修飾的甲基化GATC序列。依賴於Mut S、Mut L及DNA解鏇酶(Mut U)的協同作用,隨著新生鏈錯配區的切出，整個修復反應即被啟動。總之,修復反應包括切出含鹼基錯配區的DNA，被切出區域的重新合成以及連線等三個步驟。
2、hMSH2基因在結直腸腫瘤中的突變
2.1 SCRC 結直腸癌分為遺傳性結直腸癌和SCRC，其中80％以上的結直腸癌為SCRC。結直腸癌的發生是一個涉及多基因改變的多步驟的累積過程。基因不穩定性在結直腸癌發生中起重要作用。這可分為二種不同形式，即染色體不穩定性(chromosome instability)，亦稱腫瘤抑制途徑(suppressor pathway)和微衛星不穩定性(mirosatellite instability,MSI)，也稱MSI途徑(MSI path way)。前者與Fearon等提出的模式相似，由於染色體的不穩定性,使染色體大片段丟失、易位和重排，導致大量異倍體細胞；而在後者，由於錯配修復基因突變，使單核苷酸水平突變率增加，導致廣泛的MSI。文獻報導約10％～15％的SCRC表現為MSI，90％的HNPCC可檢測到MSI。根據MSI檢出位點的多少，可將散發性結直腸癌分為高頻率MSI(MSI H),低頻率MSI(MSI L)和無MSI(MSS)，MSI H結直腸癌表現為高頻率的TGF-βRⅡ、IGF-ⅡR、BAX、hMSH3基因的移碼突變和低頻率的APC、MCC和DCC的雜合丟失，而MSI L和MSS結直腸癌卻表現為相反結果。最近研究發現，除上述基因改變外，MSI H結直腸癌還表現為錯配修復基因hMSH2和hMLH1錯配修復基因表達的下調等，而MSI L和MSS結直腸癌則無此表現。在MSI的臨床表型方面，MSI H多見於結直腸多發癌,多位於右半結腸，組織學上多為低分化型，少有淋巴結轉移，多數認為惡性程度較低,預後較好。以上說明MSI H散發性結直腸癌無論在臨床病理特點還是在基因改變方面均與MSI L和MSS癌有明顯不同。
在散發性結腸癌患者細胞中檢測到有DNA複製差錯陽性(RER+)的出現，一般散發性結腸癌患者DNA中RER陽性檢出率約為10%～16%，並且在一些具有微衛星DNA不穩定的散發性結腸癌患者細胞中亦篩查出有MMR基因突變的存在。Thibodeau等用位於染色體5、8、15、17、18上11個微衛星位點測508例SCRC（MSI＜30%為輕度RER+，＞30%為重度RER+），結果：重度RER+SCRC為16.1%，輕度RER+為21.3%，RER-SCRC為62.4%。分析RER+表型與患者臨床病理特徵的關係，輕度RER+SCRC患者其臨床病理特徵與RER-SCRC患者相似；重度RER+SCRC與其他兩型相比，腫瘤患者多為女性，腫瘤多位於近段結腸、為二倍體腫瘤、發病年齡較低及多處於Ducks分期的後期。對其中188例SCRC用免疫組化技術研究hMSH2，hMLH1表達情況，結果顯示，RER-SCRC（129/188）及輕度RER+SCRC（17/188），hMSH2，hMLH1蛋白表達均正常，42例重度RER+SCRC中，38（90%）例hMSH2正常，而缺乏hMLH1表達，2例正常表達，僅2例hMSH2不表達，認為hMSH2表達異常在重度RER+SCRC的發病機制中起重要作用。
2.2 HNPCC 是一種特殊類型的結直腸癌，是由於DNA錯配修復基因(MMR)發生胚系突變所致的一種單基因的顯性遺傳性疾病，又稱Lynch綜合徵，約占結直腸癌總數的15％ ～18％。本病約占家族性結直腸癌的50%，採用阿姆斯特丹標準後，占全部結直腸癌的1%～5%。國內報導發生率占同期收治結直腸癌病例的2.4%。HNPCC以男性多見,男女之比約為2.5∶1。HNPCC是一種常染色體顯性遺傳性疾病,外顯率高達80%～85%。1993年Aaltonen等首先研究發現，遺傳性非息肉性結直腸癌中存在一種DNA錯配修復基因，該基因的改變可引起微衛星不穩定性（MI）。現在已分離和鑑定的與HNPCC有關的基因主要有hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2，他們分別定位於染色體2p21-22、3p21、2q31-33和7p22。目前已檢測到hMSH2的突變為MMR中最易檢測的突變，其突變檢出率為21%～54%。這種突變主要為單鹼基的改變和由於鹼基的缺失和插入引起的移碼突變，導致下游提前出現終止密碼，而使蛋白截斷或功能缺失。hMSH2的突變主要位於其後面的外顯子上。研究證明，在HNPCC發病中起主要作用的是hMSH2和hMLH1基因,大約半數的HNPCC可檢出hMSH2或hMLH1基因突變。國內王亞平等分析了HNPCC患者外周血細胞DNA錯配修復基因hMSH2、hMLH1的突變，並證實了HNPCC的發生與錯配修復基因的突變密切相關。袁瑛等分析了29個HNPCC家系中，hMSH2基因的突變明顯高於對照組。hPMS1和hPMS2是細菌錯配修復基因mut L的同源物，分別定位於2q31～33和7p22，各包含一個2795bp和2586bp的開讀框架。
當一個家族所具備的臨床病理特點越多,發生HNPCC的可能性越大。再此應強調的是，要重視MMR基因檢測在診斷中的作用，即使只具有一個特點的家系也是如此。如果一個家系具有三項特點以上,或一個家系有3人具有特點，即為HNPCC高危家系，應進一步進行MMR基因突變分析。由於突變分析技術要求較高，操作比較繁雜，花費也大，因此如何選擇基因分析的病例就顯得非常必要。一般認為，對低危家系的結直腸癌先行MSI檢測，然後再對MSI+病例進行突變分析。
2.3 結直腸腺瘤和潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌 MMR基因的突變導致MMR系統的缺陷，可引起廣泛的體細胞突變和DNA複製錯誤，MMR功能缺失也可導致一些抑癌基因突變率的增加和突變的積累而促進腫瘤的發生。周琪等發現hMSH2基因蛋白陽性表達率從正常組織、腺瘤不典型增生、腺瘤癌變到腺癌逐漸降低，提示在腺瘤階段已經有MMR的基因的突變或功能異常，並隨其惡性程度的增加，MMR基因的突變頻率也逐漸升高。提示MMR基因的突變，尤其是hMSH2的突變可能是結直腸癌發生的早期事件之一。結直腸腺瘤不但在HNPCC中發生，而且有很多證據說明HNPCC即發生於腺瘤基礎上。HNPCC相關腺瘤與其他腺瘤有明顯不同，可以是單發，也可以是多發，組織學上多為絨毛狀腺瘤，常表現為明顯的異型性，可迅速由腺瘤發展為腺癌，因此亦稱為侵襲性腺瘤(aggressive adenoma)。有關分子生物學研究亦支持HNPCC相關腺瘤具有侵襲性的觀點。大部分HNPCC腺瘤存在基因不穩定性，檢測腺瘤MSI是發現HNPCC的有用方法。由於近來HNPCC有關基因的鑑定，我們可對基因攜帶者進行分子遺傳學診斷，這將使高危人群的數量減少一半。Russell等發現錯配修復缺陷造成的微衛星DNA重複序列數不穩定與HNPCC由腺瘤向癌惡性轉變有關。腺瘤階段，微衛星DNA重複序列數改變的比例明顯低於癌階段。這說明大多數HNPCC在良性的腺瘤階段已有部分基因向不穩定發展，微衛星DNA重複序列數改變速率越快，腺瘤惡變的可能性就越大。
潰瘍性結腸炎個體結直腸癌發生率比一般人群高20倍。Kern等證明微衛星DNA重複序列數的不穩定在潰瘍性結腸炎的異形區和結腸癌細胞中都存在。人類hMSH2基因中一個內含子剪接位點的鹼基T被C替代後，會大大增加8年以上潰瘍性結腸炎患者癌變的可能性。Cawkwell等在38例UCACRC中發現，有1例(2. 4%)存在hMSH2蛋白表達缺失，該例亦表現高水平的MSI。王赫等在研究中發現， 潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌(UCACRC)組織中hMSH2蛋白的缺失率很高，為50%(4/8)。儘管在潰瘍性結腸炎伴不典型增生(UD)組織中hMSH2蛋白的缺失率為0，但有4例(1例為重度不典型增生，3例為中度) hMSH2蛋白的表達強度很弱,提示在UCACRC癌前病變組織中可能有hMSH2基因轉錄水平的下降，從而影響hMSH2蛋白的表達,使之不能充分發揮其修復錯配DNA的功能，產生DNA複製錯誤，導致基因變異，癌基因激活或抑癌基因失活，組織發生癌變。目前UCACRC的發生髮展過程中的分子生物學變化仍不清楚,還需要進一步研究和探索。
