花菜豆酸
一、脫落酸的發現和性質(一)脫落酸的發現脫落酸(abscisicacid，ABA)是指能引起芽休眠、葉子脫落和抑制生長等生理作用的植物激素。它是人們在研究植物體內與休眠、脫落和種子萌發等生理過程有關的生長抑制物質時發現的。1961年劉(W.C.liu)等在研究棉花幼鈴的脫落時，從成熟的乾棉殼中分離純化出了促進脫落的物質，並命名這種物質為脫落素(後來阿迪柯特將其稱為脫落素Ⅰ)。1963年大熊和彥和阿迪柯特(K.OhkumaandF.T.Addicott)等從225kg4～7天齡的鮮棉鈴中分離純化出了9mg具有高度活性的促進脫落的物質，命名為脫落素Ⅱ(abscisinⅡ)。在阿迪柯特領導的小組研究棉鈴脫落的同時，英國的韋爾林和康福思)領導的小組正在進行著木本植物休眠的研究。幾乎就在脫落素Ⅱ發現的同時，伊格爾斯(C.F.Eagles)和韋爾林從樺樹葉中提取出了一種能抑制生長並誘導旺盛生長的枝條進入休眠的物質，他們將其命名為休眠素(dormin)。1965年康福思等從28kg秋天的乾槭樹葉中得到了260μg的休眠素純結晶，通過與脫落素Ⅱ的分子量、紅外光譜和熔點等的比較鑑定，確定休眠素和脫落素Ⅱ是同一物質。1967年在渥太華召開的第六屆國際生長物質會議上，這種生長調節物質正式被定名為脫落酸。（二）ABA的結構特點ABA是以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸(圖7-19)，化學名稱為5-(1′-羥基2′，6′，6′-三甲基-4′-氧代-2′-環己烯-1′-基)-3-甲基-2-順-4-反-戊二烯酸〔5-(1′-hydroxy-2′,6′,6′-trimethyl-4′-oxo-2′-cyclohexen-1′-yl)-3-methyl-2-cis-4-trans-pentadienoicacid〕，分子式為C15H20O4，分子量為264.3。ABA環1′位上為不對稱碳原子，故有兩種鏇光異構體。植物體內的天然形式主要為右鏇ABA即(+)-ABA，又寫作(S)-ABA。(三)ABA的分布與運輸脫落酸存在於全部維管植物中，包括被子植物、裸子植物和蕨類植物。苔類和藻類植物中含有一種化學性質與脫落酸相近的生長抑制劑，稱為半月苔酸(lunlaricacid)，此外，在某些苔蘚和藻類中也發現存在有ABA。高等植物各器官和組織中都有脫落酸，其中以將要脫落或進入休眠的器官和組織中較多，在逆境條件下ABA含量會迅速增多。水生植物的ABA含量很低，一般為3～5μg·kg-1；陸生植物含量高些，溫帶穀類作物通常含50～500μg·kg-1，鱷梨的中果皮與團花種子含量高達10mg·kg-1與11.7mg·kg-1。脫落酸運輸不具有極性。在菜豆葉柄切段中，14C-脫落酸向基運輸的速度是向頂運輸速度的2倍～3倍。脫落酸主要以游離型的形式運輸，也有部分以脫落酸糖苷的形式運輸。脫落酸在植物體的運輸速度很快，在莖或葉柄中的運輸速率大約是20mm·h-1。二、脫落酸的代謝脫落酸的合成部位主要是根冠和萎蔫的葉片，莖、種子、花和果等器官也有合成脫落酸的能力。例如，在菠菜葉肉細胞的細胞質中能合成脫落酸，然後將其運送到細胞各處。脫落酸是弱酸，而葉綠體的基質呈高pH，所以脫落酸以離子化狀態大量積累在葉綠體中。(一)ABA的生物合成脫落酸生物合成的途徑主要有兩條：1.類萜途徑(terpenoidpathway)脫落酸的合成是由甲瓦龍酸(MVA)經過法呢基焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)，再經過一些未明的過程而形成脫落酸。此途徑亦稱為C15直接途徑。MVA→→FPP→→ABA2.類胡蘿蔔素途徑(carotenoidpathway)脫落酸的碳骨架與一些類胡蘿蔔素的末端部分相似。塔勒(Tarlor)等將類胡蘿蔔素曝露在光下，會產生生長抑制物。後來發現紫黃質(violaxanthin)在光下產生的抑制劑是2順式黃質醛(xanthoxin)，在一些植物的枝葉中也檢出這種物質。黃質醛迅速代謝成為脫落酸。近幾年發現，除了紫黃質外，其他類胡蘿蔔素(如新黃質neoxanthix，葉黃素lutein等)都可光解或在脂氧合酶(lipoxygenase)作用下，轉變為黃質醛，最終形成脫落酸(圖7-20)。由類胡蘿蔔素氧化分解生成ABA的途徑稱為ABA合成的間接途徑。通常認為在高等植物中，主要以間接途徑合成ABA。直接途徑是指從C15化合物(FPP)直接合成ABA的過程。間接途徑則是指從C40化合物經氧化分解生成ABA的過程。(SuzukiMasaharu,1998)(二)ABA的鈍化ABA可與細胞內的單糖或胺基酸以共價鍵結合而失去活性。結合態的ABA可水解重新釋放出ABA。因而結合態ABA是ABA的貯藏形式。但乾旱所造成的ABA迅速增加並不是來自於結合態ABA的水解，而是重新合成的。(三)ABA的氧化ABA的氧化產物是紅花菜豆酸(phaseicacid)和二氫紅花菜豆酸(dihydrophaseiacid)。紅花菜豆酸的活性極低，而二氫紅花菜豆酸無生理活性。三、脫落酸的生理效應(一)促進休眠外用ABA時，可使旺盛生長的枝條停止生長而進入休眠，這是它最初也被稱為"休眠素"的原因。在秋天的短日條件下，葉中甲瓦龍酸合成GA的量減少，而合成的ABA量不斷增加，使芽進入休眠狀態以便越冬。種子休眠與種子中存在脫落酸有關，如桃、薔薇的休眠種子的外種皮中存在脫落酸，所以只有通過層積處理，脫落酸水平降低後，種子才能正常發芽。(二)促進氣孔關閉ABA可引起氣孔關閉，降低蒸騰，這是ABA最重要的生理效應之一。科尼什(K.Cornish,1986)發現水分脅迫下葉片保衛細胞中的ABA含量是正常水分條件下含量的18倍。ABA促使氣孔關閉的原因是它使保衛細胞中的K+外滲，從而使保衛細胞的水勢高於周圍細胞的水勢而失水。ABA還能促進根系的吸水與溢泌速率，增加其向地上部的供水量，因此ABA是植物體內調節蒸騰的激素，也可作為抗蒸騰劑使用。(三)抑制生長ABA能抑制整株植物或離體器官的生長，也能抑制種子的萌發。ABA的抑制效應比植物體內的另一類天然抑制劑--酚要高千倍。酚類物質是通過毒害發揮其抑制效應的，是不可逆的，而ABA的抑制效應則是可逆的，一旦去除ABA，枝條的生長或種子的萌發又會立即開始。(四)促進脫落ABA是在研究棉花幼鈴脫落時發現的。ABA促進器官脫落主要是促進了離層的形成。將ABA塗抹於去除葉片的棉花外植體葉柄切口上，幾天后葉柄就開始脫落(圖7-21)，此效應十分明顯，已被用於脫落酸的生物檢定。(五)增加抗逆性一般來說，乾旱、寒冷、高溫、鹽漬和水澇等逆境都能使植物體內ABA迅速增加，同時抗逆性增強。如ABA可顯著降低高溫對葉綠體超微結構的破壞，增加葉綠體的熱穩定性；ABA可誘導某些酶的重新合成而增加植物的抗冷性、抗澇性和抗鹽性。因此，ABA被稱為應激激素或脅迫激素(stresshormone)。
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【摘要】目的研究小葉榕葉水提物浸膏的HPLC指紋圖譜。方法色譜柱為大連依立特ODSC18（250mm×4.6mm,5μm）；以90%甲醇-水-0.2%H3PO4為流動相A，以20%四氫呋喃-水-0.2%H3PO4為流動相B，按一定比例配製，梯度洗脫；柱溫為31℃；流速為1mL/min；檢測波長為275.5nm；分析時間為120min。結果初步建立了小葉榕葉水提物浸膏的HPLC指紋圖譜，標定了19個共有指紋峰，並對7個共有指紋峰進行了標記。結論該法建立的指紋圖譜具有可靠性，可為進一步研究小葉榕葉水提物的質量標準提供依據。
【關鍵字】小葉榕葉;指紋圖譜；高效液相色譜法
基金項目：廣東省中醫藥局2005年資助項目（1050044）
HPLCfingerprintsoftheextractsofFoliumficimicrocarpae
LAIYi-qin,LIUFeng,ZHOUHong-bin,CHENJia-lin
(DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,GuangdongCollegeofPharmacy,Guangzhou,Guangdong510006,China;GuangzhouBaiyunshanPharmaceuticalGeneralFactory,Guangzhou,Guangdong510515,China)
Abstract:ObjectiveTodeterminetheHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae.MethodsTheextractswasanalyzedonanODSC18column(4.6mm×250mm,5μｍ)using90%methanol-water-0.2%H3PO4asgradienteluteA，20%tetrahydrofuran-water-0.2%H3PO4asgradienteluteB.Theflowratewas1mL/minandcolumntemperature31℃.Thedetectionwavelengthwas275.5nm.ResultsHPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpaewasestablished.Atotalof19commonpeakshavebeenidentifiedand7compoundswhichwereseparatedfromleavescouldbefoundtherelativepeaksinchart.ConclusionThefingerprintsarereliable,whichcouldbeusedforqualitycontroloftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae..
Keywords:Foliumficimicrocarpae;fingerprints；HPLC
小葉榕葉是桑科植物榕屬小葉榕FicusmicrocarpaL.f.的乾燥葉子，主要產於廣東和廣西［1］。小葉榕葉水提物浸膏作為咳特靈的主成分收載在部頒標準［2］中，用於治療哮喘和慢性支氣管炎。目前的部頒標準，只對小葉榕葉水提物浸膏做了薄層鑑別，質量標準較簡單。本文對小葉榕葉水提物浸膏進行了HPLC指紋圖譜的研究，為進一步研究和制訂小葉榕葉及其提取物HPLC指紋圖譜奠定實驗依據。
1儀器與試藥
1.1儀器
福立2000高效液相色譜儀:N2000色譜工作站，二元泵，柱溫箱，紫外檢測器。
1.2試劑
試劑均為色譜純，並用0.45μm微孔濾膜過濾。
1.3對照品
苯甲酸、1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮、2-羥基苯甲酸、4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、紅花菜豆酸、4-甲氧基-3,5-二羥基苯甲酸，均為作者從小葉榕葉水提物中分離得到的化合物，並經IR、EI-MS、NMR鑑定結構，純度經HPLC檢測大於98.5%。
1.4藥材
小葉榕葉水提物浸膏，白雲山製藥廠提供。
2方法與結果
2.1供試品溶液的製備
取小葉榕葉水提物浸膏約1g，蒸餾水溶解後，乙醇醇沉使溶液醇濃度為50%［3］，濾除不溶物，揮除乙醇直至沒有醇味，得濾液。濾液用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次［2］，得乙酸乙酯層浸膏。將乙酸乙酯層浸膏用適量的甲醇溶解，定容至10mL，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。
2.2對照品溶液的製備
取各對照品適量，甲醇溶解後，定容至1mL，用0.45μm的微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。
2.3檢測波長的選擇
取按“2.1”項方法製備的供試液進行紫外掃描，所得圖譜見圖1。從圖1可見，275.5nm處有最大吸收峰，故確定275.5nm為檢測波長。
圖1小葉榕葉供試液的紫外掃描圖（略）
Fig.1UVchromatogramoftheaqueousextractofFoliumficimicrocarpae
2.4色譜條件
色譜柱為大連依立特ODSC18（250mm×4.6mm,5μm）；流動相：以90%甲醇-水-0.2%H3PO4為流動相A，以20%四氫呋喃-水-0.2%H3PO4為流動相B，按表1比例配製進行梯度洗脫；柱溫為31℃；流速為1mL/min；檢測波長為275.5nm；分析時間為120min；進樣量為20μL。
表1梯度洗脫表（略）
Tab.1Gradientelutiontime
2.5方法學考察
2.5.1空白試驗吸取溶劑20μL，按“2.4”項條件進樣測定，記錄色圖譜，結果見圖2。從圖2可見，溶劑對測定無干擾。
圖2空白試驗（略）
Fig2HPLCchromatogramoftheblankassay
2.5.2精密度試驗取同一份供試品溶液，連續進樣5次，比較共有峰的相對保留時間及峰面積比值。結果各共有峰的相對保留時間在均值±1min內，RSD在0.2%～0.8%之間，各共有峰的峰面積比值的RSD在0.7%～2.7%之間，表明共有峰的相對保留時間和峰面積比值的RSD均符合指紋圖譜檢測要求［4］。
2.5.3穩定性試驗取同一份供試液，分別在0、2、4、6、24h進樣測定，比較共有峰的相對保留時間及峰面積比值。結果各共有峰的相對保留時間在均值±1min內，RSD在0.3%～0.8%之間，各共有峰的峰面積比值的RSD在0.8%～2.9%之間。表明供試液在24h內穩定，符合指紋圖譜檢測要求［4］。
2.5.4重現性試驗取同一批小葉榕葉水提物浸膏，按“2.1”下製備5份供試液，分別進樣測定，比較共有峰的相對保留時間及峰面積比值。結果各共有峰的相對保留時間在均值±1min內，RSD在0.3%～0.8%之間，各共有峰的峰面積比值的RSD在1.2%～2.8%之間，表明共有峰的相對保留時間和峰面積比值的RSD符合指紋圖譜檢測要求［4,5］。
2.6指紋圖譜及技術參數
2.6.1共有指紋峰的標定取3批小葉榕葉水提物浸膏，對其HPLC指紋圖譜做初步考察，初步確定了19個分離度較好且峰面積穩定的峰為共有峰。結果見圖3。
圖3小葉榕葉提取物浸膏的指紋圖譜（略）
Fig.3HPLCfingerprintsoftheaqueousextractsofFoliumficimicrocarpae
2.6.2共有指紋峰的相對保留時間根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》，確定平均保留時間為44.643min的8號共有峰為內標參照峰，其餘18個共有指紋峰與參照峰相比，相對保留時間依次為：0.1283、0.1459、0.1610、0.2628、0.3947、0.4878、0.7581、1.1026、1.3346、1.6920、1.7398、1.8135、1.8807、1.8946、2.0636、2.0788、2.1154、2.1421。
2.6.3共有指紋峰的相對峰面積根據初步研究，共有峰面積占總峰面積比值為66.310%～80.094%。保留時間小於30min的共有峰：單峰面積占總峰面積大於10％而小於20％的共有峰為5號，其相對峰面積比值為0.9102～0.9717，差值小於±25％。保留時間超過30min的共有峰：單峰面積占總峰面積大於10％而小於20％的共有峰為7號和8號，7號峰的相對峰面積比值為0.5915～0.6725，其差值小於±25％。結果符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》。
2.7部分共有峰的標記
取各對照品溶液20μL，分別注入高效液相色譜儀，HPLC色譜圖見圖3。結果確認了以下7個共有峰：11號峰為苯甲酸（75.332min），12號峰為1-(4-羥基-3,5-二甲氧基苯基)-乙酮（77.298min），7號峰為3-羥基-4-甲氧基苯甲酸（32.865min），內標參照峰為4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲酸（43.832min），6號峰為4-羥基苯甲酸（21.232min），16號峰為紅花菜豆酸（91.398min），5號峰為4-甲氧基-3,5-二羥基苯甲酸（17.165min）。
3討論
3.1目前國內文獻中，一般都以總黃酮作為咳特靈中小葉榕葉水提物的質量指標，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法［3］，或以槲皮素為對照品，用紫外分光光度法在265nm處［5］測定其總黃酮含量。但作者從小葉榕葉分離得到的7個化合物，通過HPLC檢測均為含量較大的共有峰，均不是黃酮類化合物。另外，文獻［6～8］報導，在小葉榕葉中甲醇提取物中分離出的42個化合物中也僅有3個黃酮類化合物。Al(NO3)3-NaNO2-NaOH的黃酮專屬性不強，一些具有鄰二酚羥基的非黃酮物質也會發生反應［8］。分別稱量對照品1至7，每個化合物約0.0003g。將這7個化合物混合後，用甲醇溶解，定容至10mL。取少量混合液作為空白對照進行紫外掃描，結果見圖4。吸取6mL混合液置25mL的容量瓶中，加1mL質量分數為5%的NaNO2，搖勻,放置6min，再加1mL質量分數10%的Al(NO3)3，搖勻,放置6min，最後加1mL質量分數4%的NaOH，加水至刻度,搖勻。加入NaOH後觀察到溶液從透明無色變為黃色。在15min內對反應液進行紫外掃描，結果見圖5。兩圖比較,反應後的溶液在500nm處有明顯吸收,而反應前的空白液在500nm處則無吸收。說明從小葉榕葉中分離得到的化合物，混合後也能發生Al(NO3)3-NaNO2-NaOH反應。綜上所述，作者認為以總黃酮作為小葉榕葉水提物浸膏的質量指標，用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法進行測定的方法是否合理，值得進一步探討，建立其HPLC指紋圖譜可能更科學。
圖4空白對照紫外掃描圖（略）
Fig.4UVchromatogramofblankassay
圖5反應後紫外掃描圖（略）
Fig.5UVchromatogramofreaction
3.2由於條件和時間限制，本文只對3批小葉榕葉水提物浸膏的HPLC指紋圖譜做了初步研究，共有峰面積占總峰面積的平均比值為73.247%，暫未達到《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》中非共有峰總面積不得大於總峰面積10％的要求。今後將收集不同產地的小葉榕葉作進一步的研究。
【參考文獻】
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相關網站
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