淋巴管內皮

淋巴管內皮細胞(lymphatic endothelial cells, LEC)是構成淋巴管壁的主要結構,參與維持體液平衡、調節淋巴細胞再循環和機體免疫反應等生理過程. 近年研究表明,LEC還在傷口癒合、淋巴管水腫和炎症擴散等病理過程中起重要作用,而且與腫瘤轉移密切相關[1]. 但是,由於原代分離和體外培養LEC均比較困難,國內外有關此方面的報導較少,且多集中於牛、豬等大型動物和人身上,因此大大限制了人們對LEC的認識和研究. 我們套用不完全弗氏佐劑誘導小鼠腹腔淋巴管瘤形成為細胞來源,以自制鼠尾膠作為貼黏劑培養LEC,旨在建立一個簡便、廉價和穩定的小鼠LEC培養體系.

1材料和方法.1.1材料雌性健康Balb/c小鼠10隻(第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心),4~6 wk齡,體質量(19.1±1.3) g;雄性健康SD大鼠2隻(第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心),12 wk齡,體質量(230.4±15.4) g. 含多種生長因子的EBM2培養基(英國Cambrex公司);胎牛血清(FBS,美國HYclone公司);不完全弗式佐劑(美國Sigma公司);兔抗鼠VEGFR3抗體,兔抗鼠LYVE1抗體(美國Santa cruz公司);FITC標記的羊抗兔IgG(武漢博士德公司);3HTdR(北京原子能研究所). 烏拉坦(1 mL/100 g)ip麻醉大鼠,剪下鼠尾,750 mL/L乙醇消毒3 min. 去皮,950 mL/L乙醇固定15 min. 抽出肌腱,750 mL/L乙醇消毒30 min,三蒸水反覆沖冼以去除殘餘乙醇. 充分剪碎,移入三角燒杯,加入5 mL/L醋酸溶液200 mL,4℃搖動過夜. 次日吸取上層液體,4000 r/min離心30 min,收集上清即為鼠尾膠. 取少量鼠尾膠加入培養瓶中(以全部覆蓋瓶底為宜),5 min後吸掉鼠尾膠,室溫放置過夜以備培養LEC之用;按同法包被下述實驗需要的培養板和製備爬片所需的蓋玻片. 按參考文獻[2]將不完全弗氏佐劑與PBS按1∶1混勻,製成乳懸液. 取8隻小鼠,ip 0.2 mL;15 d後加強注射1次. 2 mo後處死小鼠. 另設2隻小鼠注射相同體積的無菌PBS作為對照.

1.2方法打開小鼠腹腔,取出淋巴管瘤. 將其剪碎成約0.5 mm3大小,加入I型和II型膠原酶1∶1配成的1 g/L溶液5 mL,37℃恆溫搖床消化組織塊30 min,800 r/min離心10 min收集細胞,殘餘組織塊用2.5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA溶液37℃搖床消化15 min,離心收集細胞,將兩次收集的細胞混合,80 μm尼龍網過濾,台盼藍計數. 之後,將細胞接種到鼠尾膠包被的培養瓶中,使用含多種生長因子的EBM2完全培養基,37℃,50 mL/L CO2孵箱中培養.

1.2.1LEC的鑑定取培養2~3代的LEC 1×106個接種於鼠尾膠包被的6孔培養板中,同時分別將鼠尾膠包被的蓋玻片置於其中. 24 h後取出蓋玻片,40 g/L甲醛固定20 min. 30 mL/L H2O2室溫封閉10 min後,再用20 mL/L山羊血清封閉20 min. 分別以兔抗鼠VEGFR3抗體或LYVE1抗體和FITC標記的羊抗兔IgG為一抗和二抗進行免疫螢光檢測,以PBS代替一抗作為陰性對照.

1.2.2LEC的增殖活力測定取培養2~3代的LEC於實驗前晚半量換液,實驗時取1×106個,以不含FBS和生長因子的培養液洗滌3次,最後將細胞懸浮於0.5 mL完全培養液中;加3HTdR 370 kBq,放入孵箱孵育3 h,每0.5 h輕搖1次;標記結束時加FBS數滴,洗去游離同位素,加完全培養液洗浴30 min,調整細胞密度2×108/L備用. 取LEC 0.25 mL/孔(5×104/孔)接種於鼠尾膠包被的24孔板,隨機分組為:①空白對照組(使用不含生長因子和FBS的EBM2培養基);②無生長因子組(使用只含FBS的EBM2培養基);③無FBS組(使用只含生長因子的EBM2培養基);④完全培養基組(使用既含生長因子又含FBS的EBM2培養基). 在孵箱中作用20 h後,低速離心5 min,輕棄上清0.1 mL;加混合酶(8 g/L胰蛋白酶與0.5 g/L DNA酶在作用前對倍稀釋而成)0.1 mL,作用30 min後,收集細胞於玻璃纖維濾紙上,烘乾後放入閃爍杯送檢cpm,換算成Bq,代表3HTdR的摻入量,反映LEC的增殖狀況. 每份設3個復孔,取其平均值計算. 另按1×104/孔接種LEC於24孔培養板,分別在1,6,12,24,48,72,96,120 h取3孔計數活細胞(4 g/L台盼藍拒染),實驗重複3 次,取其平均值,繪出生長曲線,並按公式DT=t log2/(log Nt-log No)計算其細胞倍增時間. t表示對數生長期細胞培養時間,Nt為對數生長期終末時的細胞數,No為對數生長期起始時的細胞數. 以未用鼠尾膠包被的培養孔作為對照.

1.2.3淋巴管形成試驗先將鼠尾膠鋪滿6孔培養板底部,置濃氨水棉球片刻,1 h後即形成膠原凝膠. 每孔接種1×105個LEC,補加完全培養液適量,置於37℃,50 mL/L CO2孵箱培養. 每天使用相差倒置顯微鏡觀察淋巴管樣結構形成的情況. 以未用鼠尾膠包被的培養孔作為對照.統計學處理:計量資料以x±s表示,採用統計軟體SPSS 11.0分析,組間比較用非參數秩和檢驗.

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