藍白斑篩選

藍白斑篩選

藍白斑篩選是一種基因工程常用的細菌重組質粒的篩選方法。野生型大腸桿菌(E.Coli)產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養菌落產生顏色變化,而顏色變化是鑑定和篩選的最直觀有效的方法。藍白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。當外源DNA與含lacz'的載體連線時,會插入進MCS,使α肽鏈讀碼框破壞,這種重組質粒不再表達α肽鏈,將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用,不產生活性β-半乳糖苷酶,即不可分解培養基中的X-gal產生藍色,培養表型即呈現白色菌落。

基本信息

簡介

藍白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。

原理

藍白斑篩選藍白斑篩選
藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法:是根據載體的遺傳特徵篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個胺基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它並不破壞讀框,但可使少數幾個胺基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用於可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣,lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落,因而易於識別。然而,當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連線產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr後,有重組質粒的細菌形成白色菌落。

方面

藍白斑篩選藍白斑篩選
設計適用於藍白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變,造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個胺基酸的短肽(即α肽鏈),從而不具有生物活性,即無法作用於X-gal產生藍色物質。用於藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz'的基因,lacz'中包括:一段β-半乳糖苷酶的啟動子;編碼α肽鏈的區段;一個多克隆位點(MCS)。MCS位於編碼α肽鏈的區段中,是外源DNA的選擇性插入位點。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶,但當菌體中含有帶lacz'的質粒後,質粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補,具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力,這種現象即α-互補。
操作中,添加IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動子,在含有X-gal的固體平板培養基中菌落呈現藍色。以上是攜帶空載體的菌株產生的表型。當外源DNA(即目的片段)與含lacz'的載體連線時,會插入進MCS(即靶基因),使α肽鏈讀碼框破壞,這種重組質粒不再表達α肽鏈,將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用,不產生活性β-半乳糖苷酶,即不可分解培養基中的X-gal產生藍色,培養表型即呈現白色菌落。
實驗中,通常藍白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養基中同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應的抗生素,這樣,一次篩選可以判斷出:未轉化的菌不具有抗性,不生長;轉化了空載體,即未重組質粒的菌,長成藍色菌落;轉化了重組質粒的菌,即目的重組菌,長成白色菌落。

分子生物學實驗技術

分子生物學(molecularbiology) 是從分子水平研究作為生命活動主要物質基礎的生物大分子結構與功能,從而闡明生命現象本質的科學。而分子生物學的各種實驗方法,是本學科得以高速發展和不斷取得突破性成就的基礎。隨著學科的發展和各相關交叉學科的進步,分子生物學實驗技術必定會越來越高效與精準,成為人類探索自然、改善自然的有力工具。

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