藍白斑篩選原理

藍白斑篩選原理

藍白斑篩選是一種基因工程常用的細菌重組質粒的篩選方法。野生型大腸桿菌(E.Coli)產生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。有色物質可以使整個培養菌落產生顏色變化,而顏色變化是鑑定和篩選的最直觀有效的方法。

基本信息

具體內容

藍白斑篩選培養基藍白斑篩選培養基

藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法:是根據載體的遺傳特徵篩選重組子,如α-互補抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個胺基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它並不破壞讀框,但可使少數幾個胺基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用於可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣,LacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落,因而易於識別。然而,當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。

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如用藍白斑篩選則經連線產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr後,有重組質粒的細菌形成白色菌落

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