bb[考馬斯亮藍]

考馬斯亮藍(coomassie brilliant blue)一定範圍內與蛋白質濃度成正比,因此可用於蛋白質的定量測定。

適用範圍

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果,如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用於細胞骨架的檢驗。

操作步驟

濃染液

將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50mL 95%乙醇,加入100mL 85%的磷酸,然後,用蒸餾水補充至1000mL,此染液放4℃至少6個月保持穩定。

樣本準備

儘量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪製標準曲線。

溶解

將待測樣本溶於100~1緩衝溶液中,該緩衝溶液應與製作標準曲線的緩衝溶液相同(最好用PBS)。

稀釋

按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉澱,過濾除去。

作用

每個樣本加5mL

稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合後,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.

計算

根據標準曲線計算待測樣本的濃度。

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