考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍法

也稱考馬斯藍染色法(coomassie blue staining)又稱Bradford法,是 Bradford 於 1976 年建立起來的一種蛋白質濃度的測定方法。 由於其突出的優點,正得到越來越廣泛的套用。

方法簡介

考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色,最大光吸收在488nm;當它與蛋白質結合後變為青色,蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比,因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速;其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法是1976年Bradford建立,試劑配製簡單,操作簡便快捷,反應非常靈敏,靈敏度比Lowry法還高4倍,可測定微克級蛋白質含量,測定蛋白質濃度範圍為0~1 000μg/mL,最小可測2.5μg/mL蛋白質,是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速,常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢,但是可以被洗脫下去,所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程:

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1.Bradford濃染液的配製:將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸,然後,用蒸餾水補充至200ml,此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2.標準曲線蛋白質樣本的準備:儘量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪製標準曲線。

3.將待測樣本溶於緩衝溶液中,該緩衝溶液應與製作標準曲線的緩衝溶液相同(最好用PBS)。

4.按1:4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉澱,過濾除去。

5.每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合後,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min.

6.根據標準曲線計算待測樣本的濃度。

注意:

考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合,反應快速,並且穩定,無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右,皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。

適用範圍

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後,其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下,當溶液中的蛋白質濃度不同時,就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式,而且這種轉變有一定的數量關係。一般情況,當溶液中的蛋白質濃度增加時,顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加,因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。長期以來,人們一直習慣用 Lowry 法來測定蛋白質濃度, 但近些年來, 越來越多的人開始用考馬斯亮藍 G-250顯色法來測定蛋白質濃度,與 Lowry 法相比,該方法具有下列優點:①方法簡單,只需一種顯色液。②反應迅速,只需一步反應,顯色可在 5 min 之內完成。③干擾少,許多被認為對 Lorwy 法有干擾的物質(如糖、緩衝液、還原劑和絡合劑)不影響該方法。儘管該方法有如此多的優點,但在實際套用中也有其缺點,如線性關係不很好,因此使用該方法測定蛋白質濃度時應特別注意。

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