DNA的PCR擴增

DNA的PCR擴增是PCR是聚合酶鏈反應。該反應是根據DNA變性,復性原理設計的。

Ⅰ.基本概念

反應系統中包括含目的基因的微量樣品,耐熱的DNA聚合酶,4種dNTP(脫氧核苷酸)以及兩種過量的引物。引物一般長20-30bp(可以用人工合成)。

Ⅱ.反應步驟

該反應分三步進行:

a.DNA模板(目的基因和引物)高溫度變性(95°C) 使之解鏈。

b.降溫復性(40°C-60°C),使目的基因與引物雜交。

c.在70°C-75°C的溫度下,DNA聚合酶進行酶促聚合反應,使目的基因DNA序列在3’位置上逐漸延伸。新合成的引物延伸鏈又可以作為下一步反應的模板,如此反覆循環進行,按照2^n的指數擴增,短時間內可獲得大量的DNA目的基因。

Ⅲ.DNA的變性與復性

DNA的PCR擴增是根據DNA變性,復性原理設計的,變性與復性的簡介如下。

變性

DNA變性是指核酸雙螺旋鹼基對的氫鍵斷裂,雙鏈變成單鏈,從而使核酸的天然構象和性質發生改變。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂,鹼基間的堆積力遭到破壞,但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素,如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醯胺等,均可引起核酸分子變性。

變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變: 1)溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構,變性後代之以柔軟而鬆散的無規則單股線性結構,DNA粘度因此而明顯下降。? 2)溶液旋光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變,使DNA溶液的旋光性發生變化。 3)增色效應(hyperchromic effect)。指變性後DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子中鹼基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中鹼基藏入內側,變性時DNA雙螺旋解開,於是鹼基外露,鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收,故而產生增色效應。

復性

DNA的復性指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻後即可復性,此過程稱之為" 退火"(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見後)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡要說明之。

變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長時間,其吸光率會逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線特徵可以基本恢復到第一次變性曲線的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動顯著減弱互補鏈結合的機會自然大大減少。從熱運動的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利於復性。復性時溫度下降必須是一緩慢過程,若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利於復性。

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