甲狀腺球蛋白基因多態性與自身免疫性甲狀腺病的相關性
【摘要】目的:檢測中國人甲狀腺球蛋白（Tg）基因的外顯子10,12,33是否存在單核苷酸多態性(SNP)，研究其與自身免疫性甲狀腺疾病（AITD）的關係.方法:對228例AITD患者［其中Greaves病（GD）146例，橋本甲狀腺炎（HT）82例］和131例健康對照者採用PCRRFLP方法檢測Tg基因外顯子10,12和33的SNPs.結果:①Tg基因存在E10SNP24T/G,E10SNP158T/C，分別為E12SNPA/G和E33SNPC/T多態性位點.②四個位點基因型及等位基因頻率在AITD組或GD亞組或HT亞組與正常對照組之間差異無統計學意義(P>0.05).③E10SNP24與E10SNP158，E12SNP與E10SNP24,E12SNP與E10SNP158之間存在連鎖不平衡，D′值分別為0.96,0.73和0.74.④HT患者的E33SNP為C等位基因時，E12SNPA，E10SNP24G和E10SNP158C在同一染色單體的基因頻率顯著多於對照組（P<0.01,OR=3.06）.結論：中國北方漢族人存在Tg基因外顯子10,12和33的單核苷酸多態性（SNP），且證實Tg基因與此類人群HT的發病有關.
【關鍵字】自身免疫性甲狀腺疾病;Graves病;橋本氏甲狀腺炎;甲狀腺球蛋白；單核苷酸多態性
0引言
Graves病（Gravesdisease,GD）及橋本氏甲狀腺炎（Hashimotosthyroiditis,HT）是自身免疫性甲狀腺病(autoimmunethyroiddisease,AITD)的主要臨床病理類型.遺傳因素在AITD的發生中起重要作用.二十餘年來的研究尚未證實甲狀腺過氧化物酶基因、促甲狀腺激素受體基因為AITD的易感基因［1-2］.有關甲狀腺球蛋白（thyroglobulin,Tg）基因與AITD相關性的研究國外僅有較少報導，來自不同人群的結論也不一致，在美國白人中發現的Tg基因與AITD的相關性在英國高加索人和日本人中並不存在［3-5］，因此我們首先就Tg基因與中國北方漢人AITD的相關性進行了研究.
1材料和方法
1.1材料實驗組為在西安交通大學第一附屬醫院內分泌專科門診收集的AITD患者228（男48，女180）例，年齡36.7±14.2歲.其中GD146(男32，女114)例，年齡37.6±14.4歲；HT82(男16，女66)例，年齡35.5±13.8歲.GD和HT的診斷依據為典型的臨床表現和實驗室檢查.對照組為按AITD患者的年齡分布、性別構成隨機選取的西安交通大學第一附屬醫院查體中心的健康人131（男30，女101）例,年齡34.6±13.3歲.離心柱型血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒與PCR擴增試劑盒2×TaqPCRMasterix購自北京天為時代公司；限制性內切酶HpyCH4Ⅲ,BsaAI,BlpⅠ均購自紐英倫生物技術有限公司；AvaⅠ購自寶生物工程有限公司；引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成.
1.2方法
1.2.1外周血基因組DNA的提取清晨空腹靜脈血EDTA抗凝，提取外周血基因組DNA.
1.2.2PCR和酶切分析在NCBI網站GenBank中找到甲狀腺球蛋白外顯子10，12和33的基因序列，按文獻［4］報導的三個外顯子的突變區域，用PRIMER5.0引物設計軟體進行引物設計.外顯子33的上游引物序列為5′ATCCACTCATGCATATTGACCA3′；下游引物為5′AGCCATGTCTCAGCTACCACA3′.外顯子12的上游引物為5′TACTGTGCAAGGAGCCTTTGT3′；下游引物為5′GGCTGGTAGAAGTTTCCTGCT3′.外顯子10的上游引物為5′CTGCAGTGCTGATCACCAACT3′；下游引物為5′ATCTTCACTAGCAGCTTGGCA3′.
PCR反應體系均為25μL,含2×TaqPCRMasterix12.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA1.5μL.限制性內切酶酶切反應總體積均為20μL，不同的酶在反應體系液中的濃度按說明書加入，37℃水浴孵育過夜.
統計學處理：讀取個體樣本，計算各組基因型及等位基因的頻率，採用SPSS11.5軟體行統計學處理，對組間計數資料顯著性檢驗用行列表χ2檢驗，對不符合四格表χ2檢驗的數據，進行Fisher確切機率法分析.用NCBI官方網站提供的SHEsis線上計算平台［6］，計算LD值.進行單體型分析，計算OR值.
2結果
2.1PCR及酶切反應外顯子33PCR擴增片段長度為411bp.以HpyCH4Ⅲ酶切後，E33SNP的TT基因型在凝膠上得到275bp,136bp兩個片斷；雜合型TC得到275,180,136,95bp四個片段(圖1).
1,6~7:雜合基因型TC酶切產物;2~4,8~9:純合基因型TT酶切產物;5:DNAmarker.
圖1外顯子33酶切圖
外顯子12PCR擴增片段長度為494bp.以BsaAⅠ酶切後，E12SNP的AA基因型得到401bp,93bp兩個片斷；GG基因型得到248,153,93bp三個片斷；而雜合型TC得到401,248,153,93bp四個片段(圖2).
1,3:雜合基因型AG酶切產物;2:純合基因型AA酶切產物;4~6,8:純合基因型GG酶切產物;7:DNAmarker.
圖2外顯子12酶切圖
外顯子10PCR擴增片段長度為452bp.以BlpⅠ酶切後E10SNP24位點GG基因型得到237bp，215bp兩個片斷；雜合型TG得到452，237，215bp三個片段(圖3).以AvaⅠ酶切後，E10SNP158位點為CC基因型時得到368bp，84bp兩個片斷;雜合型TC得到452，368，84bp三個片段(圖4).
1,3,5~6:雜合基因型TG酶切產物;2:純合基因型GG酶切產物;4:DNAmarker.
圖3外顯子10E10SNP24位點酶切圖
1~2:雜合基因型TC酶切產物;3,5~7:純合基因型CC酶切產物;4:DNAmarker.
圖4外顯子10E10SNP158位點酶切圖
2.2各組間各個位點的基因型及等位基因分布頻率比較AITD組與正常組之間，GD組及HT組與正常組之間，各組內男性與女性之間，4個位點基因型及等位基因頻率的差異無統計學意義(P＞0.05).按性別分層後，各病例組與正常組相同性別之間等位基因及基因型分布頻率的差異無統計學意義(表1，P＞0.01).表1AITD組與正常組各個位點的等位基因及基因型的分布頻率
2.3連鎖不平衡分析對四個位點進行連鎖不平衡分析發現，E10SNP10與E10SNP158之間有較強的連鎖不平衡，其D′值為0.96，r2=0.91,E12SNP與E10SNP24，E12SNP與E10SNP158間也達到了有意義的連鎖不平衡，D′值分別為0
.73，0.74；r2值分別為0.46,0.46.
2.4單體型遺傳分析對四個位點進行單體型遺傳分析，發現了6種通常出現的單體型，以E33SNP，E12SNP，E10SNP24，E10SNP158為順序，其分別為CATT,CAGC,CGTT,CGGC,TATT,TGGC.此6種單體型在AITD組與正常組，GD組與正常組之間的分布差異無統計學意義(P＞0.05).在HT組發現，無論E33SNP位點為何種等位基因，其他三個位點為AGC單體型的頻率增加，當E33SNP位點為C等位基因時，與其他三個位點共組成單體型CAGC的頻率在HT組與正常對照組間的差異具有統計學意義（P<0.01,OR=3.06,OR的95%可信區間為［1.33~7.09］）(表2).表2橋本式甲狀腺炎組的單體型分析
3討論
全基因掃描及連鎖分析在日本人群及高加索人群中證實Tg基因與AITD連鎖並與其相關［7-8］；儘管在美國高加索人種和英國高加索人種中均發現E10SNP24T/G,E10SNP158T/C,E12SNPA/G,E33SNPC/T四個基因多態性位點，但是病例對照研究卻得到不同的結論.我們的研究在中國北方漢族人群中證實了上述4個位點存在基因多態性，但是，我們發現中國人群上述四個等位基因與基因型的分布頻率與高加索人種各等位基因及基因型的分布頻率具有顯著性差異.以外顯子33為例，中國正常人群此位點C等位基因頻率為76.9%，基因型以CC為主，頻率為61.3%，而高加索人種此位點C等位基因頻率為53.9%，基因型以TC為主，頻率大於45%［4-5］,這就證實了不同種族的基因多態性不同.同時，我們還發現CAGC單體型在HT組出現的頻率顯著多於正常對照組，因此我們認為Tg基因在中國北方漢族人群中與HT具有相關性.我們的研究初步證實在中國北方漢族人中Tg基因是HT的相關基因.
［1］DeRousN,ShieldsDC,MisrahiM,etal.AnalysisofthethyrotropinreceptorasacandidategeneinfamilialGravesdisease［J］.ClinEndocrinolMetab,1996,81(10):3483-3486.
［2］OkosiemeOE,ParkesAB,PremawardhanaLD,etal.Thyroglobulin:Currentaspectsofitsroleinautoimmunethyroiddiseaseandthyroidcancer［J］.MinervaMed,2003,94(5):319-330.
［3］BanY,GreenbergDA,ConcepcionE,etal.Aminoacidsubstitutionsinthethyroglobulingeneareassociatedwithsusceptibilitytohumanandmurineautoimmunethyroiddisease［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(25):15119-15124.
［4］CollinsJE,HewardJM,HowsonM.Commonallelicvariantsofexons10,12,and33ofthethyroglobulingenearenotassociatedwithautoimmunethyroiddiseaseintheUnitedKingdom［J］.ClinEndocrinolMetab,2004,89(12):6336-6339.
［5］BanY,TozakiT,TaniyamaM,etal.AssociationofathyroglobulingenepolymorphismwithHashimotosthyroiditisintheJapanesepopulation［J］.ClinEndocrinol(Oxf),2004,61(2):263-268.
［6］ShiYY,HeL.SHEsis,apowerfulsoftwareplatformforanalysesoflinkagedisequilibrium,haplotypeconstruction,andgeneticassociationatpolymorphismloci［P］.CellRes,2005,15(2):97-98.
［7］SakaiK,ShirasawaS,IshikawaN,etal.Identificationofsusceptibilitylociforautoimmunethyroiddiseaseto5q31q33andHashimotosthyroiditisto8q23q24bymultipointaffectedsibpairlinkageanalysisinJapanese［J］.HumMolGenet,2001,10(13):1379-1386.
［8］TomerY,GreenbergDA,ConceptionE,etal.Thyroglobulinisaspecificgeneforthefamilialautoimmunethyroiddisease［J］.ClinEndocrinolMetab,2002,87(7):404-407.
