斑點印跡雜交

斑點雜交(Dot blot)是將被檢標本點到膜上,烘烤固定。這種方法耗時短,可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品,為使點樣準確方便,市售有多種多管吸印儀(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它們有許多孔,樣品加到孔中,在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反覆沖洗進樣孔,取出膜烤乾或紫外線照射以固定標本,這時的膜就可以進行雜交。

介紹

(1)DNA斑點雜交:
①先將膜在水中浸濕,再放到15×SSC中。
②將DNA樣品溶於水或TE,煮沸5min,冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣於膜上,每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。
④將膜烘乾,密封保存備用。
(2)RNA斑點雜交:與上法類似,每個樣品至多加10μg總RNA(經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化),方法是將RNA溶於5μl DEPC水,加5μl甲醛/SSC緩衝液(10×SSC中含6.15mol/L甲醛),使RNA變性,然後取5-8μl點樣於處理好的濾膜上,烘乾。
(3)完整細胞斑點雜交:套用類似檢測細菌菌落的方法,可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測,將整個細胞點到膜上,經NaOH處理,使DNA暴露、變性和固定,再按常規方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用於篩選大量標本,因為它使細胞直接在膜上溶解,所以DNA含量甚至比常用的提取法還高,又不影響與32P標記的探針雜交,但它不適用於非放射性標記探針,因為DNA純度不夠,會產生高本底。

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