介紹原位PCR[1]
做原位PCR時組織處理有何要求？
處理後的標本，既要保持組織，細胞的形態結構，並增加細胞膜通透性，又要充分暴露擬擴增的目的DNA或RNA，使引物、探針能有效進入胞漿中發生反應。
原位PCR實驗主要的套用範圍有哪些？
主要套用於兩方面；（1）檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）觀察病原體在體內分布規律（3）內源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。（4）檢測導入基因；（５） 遺傳病基因檢測如β－地中海貧血。
原位PCR實驗的大致過程是什麼？
實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為多聚甲醛固定組織或細胞，蛋白酶消化處理組織；在組織細胞片上滴加PCR反應液進行擴增，覆蓋並加液體石蠟後，在原位PCR儀上進行PCR循環擴增，PCR擴增結束後用標記的探針進行原位雜交，最後顯微鏡觀察結果。
做原位PCR實驗玻片怎么處理？
清潔液清洗→自來水沖，烘乾→強酸24h→自來水，蒸餾水洗，烘乾95％乙醇數小時→烘乾，高壓消毒。再用多聚賴氨酸APES(3-氨丙基三乙氧矽烷)包被。
固定液的選擇標準是什麼？
保持組織結構，最大限度地保持細胞內DNA或RNA水平，使引物和探針更易於進入細胞內，在規定的時間內進行反應。
原位PCR實驗所採用的組織固定液和固定時間有哪些？
固 定 劑 固 定 時 間
細 胞組 織
甲醇／丙酮(1:2) 4min 20min
甲醇／丙酮(1:1) 4min 20min
4％多聚甲醛 30min 60min
2％戊二醛 30min 60min
10％中性福馬林 overnight overnight
PCR和原位PCR在概念上有什麼區別？
PCR是提取細胞或組織中的DNA進行基因擴增反應，而原位PCR是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，而且還可以了解靶DNA存在於何種細胞中，更有利於探討靶DNA與細胞之間的關係。
PCR所採用的反應體系能否套用於原位PCR，各反應成分有什麼異同？
PCR與原位PCR所採用的反應體系中都包括Taq聚合酶緩衝液、Mg2＋、K＋、4×dNTP、一對特異性引物和Taq聚合酶。但是由於組織細胞間質會吸附Mg2＋，所以原位PCR中採用的Mg2＋濃度要比PCR的要高，採用4.5-5.5mM可以保證有足夠的Mg2＋進行反應。另外由於原位PCR中的基因擴增過程中，各反應成分須經過滲透到靶DNA處才能進行擴增，所以建議將反應循環數增加到35 個。
做原位PCR需要什麼特殊設備？
原位PCR反應是在載玻片的平面上進行，保持水平可以使反應各組分均勻地分布在組織切片上，所以須在原位PCR儀上進行，該儀器不但可以使載玻片保持水平，而且還可以給載玻片進行均勻地加熱，保證擴增反應的順利進行。
用於原位PCR檢測的探針有哪些？
與原位雜交一樣，檢測原位PCR結果的探針可以是DNA探針，也可以是寡核苷酸探針，DNA探針的長度在100－200bp為宜，寡核苷酸探針為多個，在20－40bp為宜。
用於原位PCR檢測的探針標記物有哪些？
常用標記物有地高辛半抗原（digaoxigenin），生物素（biotin），過氧化物酶（HRP），還可以標記一些螢光物質如異硫氰酸螢光素（FITC），花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。
怎樣設定原位PCR對照實驗？
設立陽性對照，即用已知陽性細胞或組織切片做陽性標誌，實驗結果應呈陽性，表明實驗方法準確可靠。同時要設立陰性對照，即用已知陰性細胞或組織切片作陰性對照，實驗結果應呈陰性，表示實驗方法無假陽性結果；也可以用實驗細胞或組織切片，不加標記的dUTP（直接法），PCR結果顯示陰性，或不加引物或不加TaqDNA聚合酶等，結果均應陰性。
原位PCR中直接法和間接法有何異同？
直接法：進行原位PCR擴增以前，把同位素或非同位素(常用)標記的核苷(如dig-dUTP及Biotin-dUTP)標記的底物或引物5’未端連線標記物加入PCR反應液中，隨著擴增的進行，標記的核苷或引物直接摻入到PCR產物中，然後免疫組化直接進行檢測。間接法：先進行細胞內目的DNA基因原位擴增，然後用標記的探針進行核酸分子原位雜交以定位檢測擴增的ＤＮＡ的技術，步驟相對較多，需時長，但結果可靠。
獲得特異的原位PCR結果需要考慮哪些關鍵因素？
原位PCR技術操作包括了組織學技術、PCR技術、原位雜交技術及免疫組化學技術，因此在複雜的操作過程中，有很多因素影響實驗結果。要考慮的一些關鍵因素有待檢組織的有效固定，在PCR前的組織預處理包括酶消化使核酸有效暴露，PCR環節中要設計特異的擴增引物、Mg2＋的濃度、TaqDNA聚合酶用量、反應循環參數。間接法中用原位雜交檢測時考慮探針濃度、抗體濃度和顯色時間。
原位PCR中的組織預處理和原位雜交是否相同？
要獲得理想的原位PCR結果，需要將待檢組織進行預處理使核酸充分暴露，這和原位雜交組織預處理的原則相同。因此原位雜交中的組織預處理步驟如HCL和蛋白酶處理等同樣適用於原位PCR。
PCR相比，原位PCR有什麼優勢和不足？
PCR雖然能擴增包括福馬林固定、石蠟包埋組織的各種標本的DNA，但擴增的DNA或RNA產物不能在組織細胞中定位，因而不能直接與特定的組織細胞特徵相聯繫，這是該技術一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由於其敏感性問題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使擴增的特定DNA片段在分離細胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足。
在組織晶片上和在傳統的病理切片上進行原位PCR有什麼異同？
兩者實驗所需試劑沒有差別，但由於組織晶片的高通量特點，比起傳統的病理切片來說，所加的試劑量要遠遠低於病理切片，勞動強度也大大降低。
