免疫沉澱物

實驗過程

免疫沉澱物免疫沉澱物
免疫沉澱的實驗過程比較簡單,一般分為3個階段;①抗原溶液的製備;②裂解物非特異性本底的預處理;③免疫複合物的形成與純化。

免疫沉澱的第一步是製備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉澱的材料來源,但免疫沉澱一般採用細胞或組織製備的裂解物。裂解物的製備可採用多種方法,其中首選用溫和的去污劑如非離子去污劑來裂解細胞。該方法能溶解細胞膜,破壞蛋白質之間許多微弱的相互作用,釋放出大多數細胞內抗原。更重要的是方法十分溫和,不破壞大多數抗原的結構和酶的活力。如果對抗原結構的完整或活力要求不嚴,或者抗原結合較為緊密,可以採用比較劇烈的條件來製備裂解物,如在強變性劑的溶液中進行煮沸,然後在免疫沉澱前經過稀釋去除變性劑。一旦細胞裂解液製備好,即可進行預處理。

特性

免疫沉澱一般用於分析抗原的生化特性,因此要求抗原的純度儘可能高。抗原和抗體的相互作用與其各自的內在性質有關,故提高該技術信—噪比最容易的方法是降低本底。如用不與待檢抗原結合的非特異性抗體預處理,可以從抗原溶液中除去非特異性結合蛋白,即此法第一次是用非免疫抗體降低本底,第二次再用所研究的抗體,這樣進行二次免疫沉澱是達到純化免疫沉澱物最有效的方法。

經過預處理後,在裂解物中加入特異性抗體,由於抗體對其相應抗原的高度親和力,因此容易快速形成免疫複合物。然後,將免疫複合物經蛋白A或蛋白G結合的瓊脂糖聚丙烯醯胺微珠等固相基質進行純化。蛋白A和蛋白G對抗體的Fc段有較高的親和力。蛋白A/G與抗體結合後,通過洗滌微珠即可除去未結合的蛋白,剩下與基質結合的即是純化的抗原抗體複合物。

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