folin酚試劑法測定蛋白質含量

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的套用。這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是套用最廣泛的一種方法,由於其試劑乙的配製較為困難(現在已可以訂購),近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。

原理

此法的顯色原理與雙縮脲法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是:在鹼性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。 Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比。

器材

721型分光光度計,恆溫水浴鍋

實驗步驟

樣品測定

取1ml樣品溶液(約含20-250μg多肽或蛋白質),加入5ml試劑甲,混勻,於20-25℃放置10min.再加入0.5ml試劑乙(Folin氏試劑),立即振盪搖勻,在20-25℃保溫30min,然後於500nm處比色。以1ml水代替樣品作為空白對照。

標準曲線的制定

取14支試管分成兩組,分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml標準蛋白質溶液(250μg/ml),用水補足到1ml,然後按上述方法進行操作,測定光密度值。取兩組測定的平均值,以蛋白質濃度為橫坐標,光密度值為縱坐標,繪製標準曲線作為定量的依據。

優缺點

這個測定法的優點是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多。缺點是費時間較長,要精確控制操作時間,標準曲線也不是嚴格的直線形式,且專一性較差,干擾物質較多。對雙縮脲反應發生干擾的離子,同樣容易干擾folin-酚反應(Lowry反應)。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩衝液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響,但這些物質濃度高時,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測定。若樣品酸度較高,顯色後會色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

注意事項

進行測定時,加Folin—酚試劑時要特別小心,因為該試劑僅在酸性pH條件下穩定,但上述還原反應只在pH=10的情況下發生,故當Folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前,還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。

測定範圍

通常測定範圍是20-250μg。此法可檢測的最低蛋白質量達5μg。

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