Tm值

Tm值

天然狀態的DNA,在比較高的溫度下(70-90℃)會發生變性,這時,雙螺旋解開為單鏈,並變成無規則線團。在光學性質上則產生“增色效應”,即紫外吸收(在260毫微米波長處)值升高。這同一般結晶的熔化現象類似。引起DNA發生“熔解”的溫定範圍比較窄,只有幾度。通常以增色效應達到最大值的一半時的溫度叫DNA的熔解溫度(或熔點),以符號Tm表示。不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比關係。

影響因素

(1)G—C的含量:在一定條件下Tm高低由DNA分子中的G-C含量所決定。G-C含量高時,Tm值比較高,反之則低。這是因為G-C之間的氫鍵較A-T多,解鏈時需要較多的能量之故。Tm值和G-C的含量可用二一個經驗公式表示:

(G—C)%=(Tm-69.3)×2.44

在一定條件下(pH7.0,0.165MNaCl中)Tm值與(GC)%含量呈正比關係。因此,通過測定Tm值,可以推算出DNA分子中的鹼基百分組成。

(2)DNA所處的溶液條件:DNA溶液中離子強度低時,Tm較低,而且熔解溫度範圍較寬;離子強度較高時,Tm較高,熔解溫度範圍較窄。因此,在表示某一來源DNA的Tm值時,必須指出其測定條件。

測定

測定原理

雙鏈DNA在熱變性時吸光度的增高是溫度的函式,以相對吸光度為縱坐標,溫度為橫坐標作圖,查得吸光度增加專時的溫度,即為了Tm。

材料和試劑

小牛胸腺DNA,溶於0.1XSSC緩衝液中。

儀器

UV—365型紫外—可見—近紅外雙光束分光光度計,帶有SPR—8程式升溫儀。

測定步驟

1.以260nm測定DNA的吸光度,按50ug/ml時A=1.00計算DNA的濃度。

2.關於樣品的配製,其總容積為3ml,加入DNA的量為60ug左右;吸光度在0.3—0.4之間,再加10XSSC溶液,使待測液的緩衝液最終濃度為1XSSC。

3.以lXSSC為參比溶液,將參比杯和樣品杯加蓋密封,並在比色杯的兩側塗以矽油,樣品杯放入前槽,參比杯放入後槽,將熱電耦插入樣品蓋的金屬管內,然後測定。

4.在25℃測定A、A、A、A/A應在1。75—1。85之間,A/A應在0.5—0.6之間。

5.按下SPR—8程式升溫儀的RUN鍵,分8步自動控制升溫,在75℃後,每升高1℃記錄一次吸光度值,一直到94℃吸光度不再變化為止。

數據處理與計算

將記錄的溫度和相應的吸光度整理成表,將各吸光度乘以相應溫度的相對膨脹體積(V/V),以校正成相當於25℃水溶液體積的吸光度。用校正後的各吸光度除以25℃的吸光度,得出各個溫度的相對吸光度。

用各個溫度和相對應的相對吸光度繪製DNA熱變性曲線,熱變性曲線的中點對應的溫度為Tm值。

最後將Tm值代入經驗公式求出G-Cmol%:

lXSSC G-C=(Tm一69.3)2.44

0.1XSSC G-C=(Tm一53.9)2.44

經過氯化銫梯度離心而分離純化的小牛胸腺DNA,其Tm為87℃,G-C含量為42%。

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