ODS柱

ODS柱

ODS柱是一種常用的反相色譜柱,也叫C18柱;由於它是長鏈烷基鍵合相,有較高的碳含量和更好的疏水性,對各種類型的生物大分子有更強的適應能力,因此在生物化學分析工作中套用的最為廣泛。

簡介

ODS柱 ODS柱

ODS柱是十八烷基矽烷鍵合矽膠填料(Octadecylsilyl,簡稱ODS)。這種填料在反相色譜中發揮著極為重要的作用,它可完成高效液相色譜70~80%的分析任務。由於C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相,有較高的碳含量和更好的疏水性,對各種類型的生物大分子有更強的適應能力,因此在生物化學分析工作中套用的最為廣泛。

近年來,為適應胺基酸、小肽等生物分子的分析任務,又發展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔矽膠(20~40μm)。

分類

按鍵合到基質上的官能團可分為:

⑴反相柱:填料是非極性的,官能團為烷烴,例如:C18(ODS)、C8、C4等。

⑵正相柱:填料是極性的,官能團為-CN氰基、-NH氨基等。

⑶離子交換鍵合相: 陽離子官能團:-SOH磺酸基、-COOH羧基等。 陰離子官能團:―RN+季銨基、-氨基等。 ( 由於矽膠基質的鍵合相只能在pH=2~7.5的範圍內使用,而離子交換色譜要求有更寬的pH範圍,因此其基質現在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)

流動相

反相色譜最常用的流動相及其沖洗強度如下: HO<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<異丙醇<四氫呋喃。最常用的流動相組成是:"甲醇-HO"和"乙腈-HO",但由於乙腈具有一定的毒性,通常優先考慮"甲醇-HO"流動相。 反相色譜中,溶質按其疏水性大小進行分離,極性越大疏水性越小的溶質,越不易與非極性的固定相結合,所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質的電離狀態影響很大,進而影響其疏水性,所以在分離肽類和蛋白質等生物大分子的過程中,經常要加入修飾性的離子對物質,最常用的離子對試劑是三氟乙酸(TFA),使用濃度為0.1%,使流動相的pH值為2~3,這樣可以有效地抑制胺基酸上α羧基的離解,使其疏水性增加,延長洗脫時間,提高解析度和分離效果。 完全離子化的溶質,例如強酸或強鹼,其在反相鍵合相上的保留值很低,近於死時間流出,不能進行分析。根據離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷(A+)相反的離子(B-),稱為對離子,加入到流動相中,使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對,即中性締合物,從而增強了樣品的疏水性,加大了保留值,改善了分離效果。

正相色譜常用的流動相及其沖洗強度的順序是: 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<異丙醇。其中最常用的是正已烷,雖然其價格較貴,但80%的順、反和鄰位、對位異構體仍然要用正相色譜來進行分離。

流動相的選擇原則是:①樣品易溶,且溶解度儘可能大。②化學性質穩定,不損壞柱子。③不妨礙檢測器檢測,紫外波長處無吸收。④粘度低,流動性好。⑤易於從其中回收樣品。⑥無毒或低毒,易於操作。⑦易於製成高純度,即色譜純。⑧廢液易處理,不污染環境。

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