基本簡介
ABO血型系統正常範圍
檢查介紹
ABO血型鑑定即指ABO血型抗原的檢測。
臨床意義
ABO血型鑑定主要用於：
1、臨床輸血：當循環血量不足或大失血或貧血需進行輸血治療，在輸血前必須先選擇血型相同的供血者，再進行交叉配血，完全相同後才能輸血。
2、在皮膚、腎移植等器官移植的時候選擇ABO血型相符的供體。
3、不孕症和新生兒溶血症病因的分析。
4、親子鑑定等。
鑑定方法
ABO血型鑑定①玻片法：操作簡單，適於大量標本檢查，但反應時間長；被檢查者如血清抗體效價低，則不易引起紅細胞凝集，因此，不適於反向定型。
②試管法：由於離心作用可加速凝集反應，故反應時間短，而且，藉助於離心力可以使紅細胞接觸緊密，促進凝集作用，適於急診檢查。
紅細胞亞型抗原性弱，如抗A抗B標準血清效價低時，易造成漏檢或誤定。如加用O型（抗A、B）血清和反向定型，可避免此類錯誤。
玻片法凝集結果判斷：紅細胞呈均勻分布，無凝集顆粒，鏡下紅細胞分散。
在低倍鏡下凝集程度強弱判斷標準：
①呈一片或幾片凝塊，僅有少數單個游離紅細胞為（++++）。
②呈數個大顆粒狀凝塊，有少數單個游離紅細胞為（+++）。
③數個小凝集顆粒和一部分微細凝集顆粒，游離紅細胞約占1/2為（++）。
④肉眼可見無數細沙狀小凝集顆粒。於鏡下觀察，每凝集團中有5～8個以上紅細胞凝集為（+）。
⑤可見數個紅細胞凝集在一起，周圍有很多的游離紅細胞（±）。
⑥可見極少數紅細胞凝集，而大多數紅細胞仍呈分散分布為混合凝集外觀。
⑦鏡下未見細胞凝集，紅細胞均勻分布為（-）。
凝膠微柱法
是紅細胞抗原與相應抗體在凝膠微柱介質中發生凝集反應的免疫學方法。血型抗體為單克隆抗體，加入試劑、標本，用專用離心機離心後可直接用肉眼觀察結果或用血型儀分析。此法操作標準化，定量加樣，確保結果準確性。
抗A、抗B和抗AB標準血清標準
準血清均采自健康人，並應符合下述條件：①特異性：只能與相應的紅細胞抗原發生凝集，無非特異性凝集。②效價：我國標準抗A和抗B血清效價均在1：128以上。③親和力：我國標準要求抗A對A1、A2及A2B發生反應開始出現凝集的時間分別是15s、30s和45s；抗B對B型紅細胞開始出現凝集的時間為15s。凝集強度為3min時，凝塊不小於1mm2。④冷凝集素效價：在1：4以下。⑤無菌。⑥滅活補體。
注意事項
1、所用器材必須乾燥清潔、防止溶血，凝集和溶血的意義一樣。為避免交叉污染，建議使用一次性器材。標準血清從冰櫃取出後，應待其平衡至室溫後再用，用畢後應儘快放回冰櫃保存。
2、加試劑順序：一般先加血清，然後再加紅細胞懸液，以便核實是否漏加血清。
3、雖然IgM抗A和抗B與相應紅細胞的反應溫度以4℃最強，醫學教育網收集整理但為了防止冷凝集現象干擾，一般在室溫20℃～24℃內進行試驗，而37℃條件，可使反應減弱。
4、幼兒紅細胞抗原未發育完全、老年體弱者抗原性較弱，最好採用試管法鑑定血型。
5、玻片法反應時間不能少於10min，否則較弱凝集不能出現，造成假陰性。
6、正、反定型結果一致才可發報告。
7、反定型法：先天性免疫球蛋白缺陷，長期大量套用免疫抑制，血型抗體可減弱或消失；血清中存在自身免疫性抗體、冷凝集素效價增高、多發性骨髓瘤、免疫球蛋白異常均可造成反定型困難；新生兒體內可存在母親輸送的血型抗體，且自身血型抗體效價又低，因而出生6個月以內的嬰兒不宜做反定型。老年人血清中抗體水平大幅度下降或被檢者血清中缺乏抗A及（或）抗B抗體，可引起假陰性或血型鑑定錯誤。
鑑定原理
常用鹽水凝集法檢測紅細胞上存在的血型抗原，以及血清中存在的血型抗體，依據抗原抗體存在的情況判定血型。常規的方法有：①正向定型：用已知抗體的標準血清檢查紅細胞上未知的抗原。②反向定型：用已知血型的標準紅細胞檢查血清中未知的抗體。結果判定：凡紅細胞出現凝集者為陽性，呈散在游離狀態為陰性。ABO血型定型原則見表1-5-2。
方法學原理
根據紅細胞膜表面有無A抗原和（或）B抗原，將血型分為A，B，AB，O型4種。可利用紅細胞凝集試驗，通過正反定型準確鑑定ABO血型。所謂的正定型是指用標準抗A抗B分型血清來測定紅細胞上有無相應的A抗原或（和）B抗原；所謂的反定型，是指用標準的A型、B型細胞來測定血清中有無抗A和（或）抗B。
操作步驟
玻片法正定型
1、取清潔玻片1張，用蠟筆劃成方法，標明抗A，抗B，分別滴家抗A，抗B血清在相應的方格內，再加受檢者紅細胞1滴，混勻。
2、將玻片輕輕轉動，使血清與細胞充分混勻，連續約1-5MIN，肉眼觀察有無凝集反映，也可以用低倍鏡觀察結果。
系統
ABO血型鑑定近年來發現存在於紅細胞上的凝集原（即血型抗原）也存在於其他血細胞和一般組織細胞。所有細胞表面血型抗原的特異性可作為機體免疫系統鑑別自身和異物的標誌。因此，在臨床實踐中血型鑑定也是組織器官移植成敗的關鍵。人類血型有遺傳特性，決定血型的血型抗原即凝集原ABOA和B及其前身物H，分別受ABO三個等位基因控制。A、B基因為顯性基因，O（H）基因為隱性基因。它們的遺傳規律所顯示的父、母血型與子代血型間的關係，在法醫學上可作為否定親子關係的依據，若再配合其他血型系統的測定，則可判斷親子關係。
套用：
血型不僅在輸血上有重要意義，而且在人種學、遺傳學、法醫學、移植免疫、疾病抵抗力（或易感性）等方面都有套用價值，在輸血前，一定要檢查病人(受血者)和輸血人（供血者）的血型，並且要進行交叉配血試驗。在臨床醫學中，除輸血、移植免疫外，對新生兒溶血病、自身免疫性溶血性貧血特異性抗體的檢查，也都需要血型知識和有關技術。
ABO血型抗原具有種族差異。例如中歐地區的人群中，約40％以上的人為A型，近40％的人為O型，10％的人為B型，6％的人為AB型；而90％的美洲土著人為O型
舉例分析
通常只用兩種抗血清即抗A及抗B血清，就可將群體分為四種血型。
根據血型的遺傳規律，和臨床工作方例起見，配偶間所生子女的血型如下：
各種ABO配偶所生子女的血型:
婚配式 子女可能有的血型 子女不可能有的血型
A×A A、O B、AB
A×B A、B、O、AB無
A×ABA、B、ABO
A×O A、O B、AB
B×B B、O A、AB
B×ABA、B、ABO
B×O B、O A、AB
AB×ABA、B、ABO
AB×OA、B AB、O
O×O O A、B、AB
婚配式 A型血的可能 B型血的可能 O型血的可能 AB型血的可能
A*A 75% 0% 25% 0%
A*B 25% 25% 25% 25%
A*O 50% 0% 50% 0%
A*AB50% 25% 0% 25%
B*B 0% 75% 25% 0%
B*O 0% 75% 25% 0%
B*AB25% 50% 0% 25%
O*O 0% 0% 100% 0%
O*AB50% 50% 0% 0%
AB*AB 25% 25% 0% 50%
鑑定及分析
目的
鑑定並分析3例疑難ABO血型紅細胞抗原及血清抗體的特異性。方法：運用PCRSSP方法對3例患者ABO血型抗原進行基因分型；運用血型血清學技術對造成ABO血型正反定型不符的原因進行分析。結果：3例患者ABO血型基因分型分別為A/O、O/O、O/O。結合血型血清學技術為患者提供了安全的血液製品。結論：ABO血型基因分型技術彌補了血型血清學方法的一些不足，運用血型基因分型技術可以解決血清學方法難以鑑定的血型抗原。
資料與方法
1.1病例資料患者1， 男性，73歲，漢族， 有多次輸血史，此次入院實驗室檢查血紅蛋白（HB) 51 g/L，紅細胞壓積（HCT) 0.158 L/L,申請輸血治療。患者2，女性，42歲，漢族，曾生育１胎，無輸血史，入院時神志不清，血紅蛋白（HB) 39 g/L，血清總膽紅素（TB) 39.0 μmol/L，直接膽紅素（DB) 11.6 μmol/L，間接膽紅素（IB) 27.4 μmol/L，申請輸血治療。患者3，男性， 8個月， 漢族，先天性心臟病手術備血。3例患者都因交叉配血時ABO血型正反定型不符，送本中心檢查。
1.2基因分型試劑基因組DNA提取試劑盒、ABO血型基因分型試劑盒(B9801)均由美國G&T公司生產，TaqDNA聚合酶、MaKrer由大連寶生物工程公司提供;iCycler型擴增儀由美國BIORAD公司生產。
1.3血型血清學試劑單克隆抗A、抗B（20060202）標準血清購自長春博德生物製品公司。譜細胞（20060515）、抗人球蛋白抗IgG+C3D(20051216)均購自上海血液生物醫藥有限責任公司。單克隆IgM+IgG抗D(NDMG03801)血清購自DBL公司。ABO試劑紅細胞為本室自製。
1.4基因分型方法患者外周血中基因組DNA 提取按美國G＆T公司試劑說明書進行操作。ABO血型的PCRSSP方法：17 μl反應體系，包括反應混合液（表1）（引物、dNTPs、PCR緩衝液等）7 μl，基因組DNA 1 μl（0.05～0.1 μg/μl），含有0.5 U TaqDNA酶液1 μl，此外，用8 μl石蠟油覆蓋。擴增參數：95℃預變性 5 min；然後95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，共 30個循環；最後72℃延伸5 min。擴增產物經4%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml溴化已錠）電泳，在凝膠成像系統拍照記錄結果，擴增產物長度與預期一致者判為陽性。
表1ABO血型基因分型（略）
1.5血型血清學試驗方法ABO血型正反定型試驗、抗球蛋白試驗、吸收放散試驗、血清中不規則抗體篩選、抗體效價測定、家系調查等試驗參照文獻進行。
結果
2.1ABO血型基因PCRSSP方法分型結果患者1 ABO血型基因型A/O， 患者2 ABO血型基因型O/O； 患者3 ABO血型基因型O/O， 見圖1。
圖1ABO血型基因（PCRSSP方法）分型電泳圖（略）
M:20 bp DNA Ladder MarKer；內對照:207 bp；陽性帶A: 75 bp；陽性帶O: 127 bp。患者1:A/O；患者2:O/O；患者3:O/O
2.2血型血清學鑑定結果
2.2.1ABO血型正反定型結果3例患者ABO血型正定型試驗與反定型試驗結果不一致 。患者1血清與O型紅細胞凝集，懷疑患者血清中存在ABO以外IgM性質抗體。患者2血清與自身紅細胞和O型紅細胞均凝集，表明患者血清中存在不規則抗體，是自身抗體或冷抗體或紅細胞體內致敏。患者3正定型為O型，反定型為A型,見表2。
2.2.2不規則抗體特異性鑑定採用上海血液生物醫藥有限責任公司的譜細胞與患者1血清在鹽水介質中反應，反應格局中抗體呈現IgM抗E特異性。進一步分析抗E抗體的性質；將患者血清與2巰基乙醇（2Me）等量混合37℃水浴2 h後與譜細胞做抗球蛋白試驗，反應結果同鹽水介質結果，根據以上反應格局判斷：患者1血清中存在抗E抗體，同時具IgM、IgG兩種性質,見表3。
表23例患者室溫ABO血型正反定型結果（略）
表3患者1血清、2Me處理後血清與譜細胞反應結果（略）
2.2.3吸收放散實驗患者1血清與ODccEE型紅細胞在4℃吸收1 h,經氯仿放散，結果顯示患者血清中抗體為IgM+IgG抗E。患者2血清與3人份混合O型紅細胞在4℃過夜吸收，經56℃熱放散。結果顯示患者血清中存在冷抗體，37℃時抗體無活性。放散液中不存在IgG性質抗體,見表4。
2.2.4抗球蛋白試驗患者2紅細胞直接抗球蛋白試驗陽性（+++～++++）。根據病史及血清學分析，懷疑由藥物引起，因樣本量有限未做藥物實驗。
2.2.5抗體效價測定患者1血清中IgM+IgG抗E效價為128，IgM抗E效價為32，IgG抗E效價為64。患者2血清中冷抗體效價4℃為128，抗體在37℃無活性。
2.2.6家系調查患者3父親血型A型，患兒母親血型O型。基因分型患兒父母血型分別為A/O、O/O。
2.2.7輸血結果患者1選擇ADCcee型洗滌紅細胞多次輸注，均無輸血不良反應。患者2選擇O型洗滌紅細胞，血型血清學實驗嚴格控制在37℃室溫環境下進行，多種介質配血相合發往臨床，輸血後無不良反應。患兒3手術中輸注O型紅細胞，無任何輸血反應。
討論
ABO血型系統的血清學特點是紅細胞上缺乏相應抗原，而血清/血漿中存在對應抗體的特殊血型系統。不符合ABO血型系統規則的血型抗體（也就是抗A、抗B以外的血型抗體），一般稱為不規則抗體。在臨床上患者血清中不規則抗體是引起血型鑑定困難、疑難配型、新生兒溶血病、輸血不良反應的主要原因。本資料中患者1血清中抗E抗體具IgM抗體性質，因此在鹽水介質中呈現凝集反應，造成ABO血型正反定型不符；患者2血清中存在冷抗體，抗體在室溫具有活性，而且紅細胞直接抗球蛋白試驗陽性，干擾了正常ABO血型正反定型；患者3是由於血清中缺乏IgM抗A，影響ABO血型的判斷。在臨床上嬰幼兒ABO血型正反定型不符比較常見，多因抗體尚未產生或產生量太少，不足以引起肉眼可見的凝集反應所致［5］。此次3例疑難ABO血型的鑑定，我們套用了PCRSSP基因分型技術，快速明確了患者ABO血型基因型，通過抗體篩選和交叉配血技術，為患者提供安全有效的血液成分。PCRSSP基因分型技術是目前血型基因檢測常用方法，是根據被檢測血型基因序列突變位點的不同，分別設計一系列特異性寡合核苷酸引物，直接擴增目的基因片斷［6］，經瓊脂糖凝膠電泳分辨，再比較各引物對之間不同的反應格局來確定被檢測血型基因型。它具有分型方法簡便（整個操作程式只需兩步，即PCR擴增與凝膠電泳）、樣本檢測量要求少（0.2 ml血樣即可完成分型）等的特點。因此血型基因分型技術作為血型血清學方法的有益補充，對保證臨床輸血的及時性、有效性和安全性都具有重要意義。通過對部分臨床疑難樣本的分析我們體會到，血型基因分型技術對有長期多次輸血史、直抗陽性患者紅細胞不適合做凝集試驗的基因分型可快速明確血型，同時還具有對臨床疑難血型的鑑定不受抗原活性竟爭、不規則抗體干擾及微生物污染等因素的影響，判型準確。
