平叛治水
明神宗萬曆四十年（1612年）進士，授工部主事，進員外郎。
天啟年間任廣東副使，曾鎮壓瑤民起義。崇禎初年，任陝西按察使，時值陝西饑荒，施安南開倉放糧，賑濟饑民。崇禎二年（1629年）召為右副都御史，因當地人要求他留任而，仍令巡撫陝西，時洮河流域的羌族起義，施安南率軍招撫。施安南治陝期間，曾開龍首渠及皂河引水入城，解決西安城內水鹹不能飲用的困難；同時還疏浚鄭國渠、白渠，灌溉、三原、醴泉2縣，計田2萬餘頃。民眾自發建生祠以感念其治水的功績。
初涉軍事
崇禎五年（1632）調任南京兵部侍郎， 明崇禎十年（1637年）安慶告急，施安南率三萬明軍與農民軍交戰，陣斬八千，解安慶圍。明崇禎十一年（1638年）施安南再次率一萬明軍，在四個月里與農民軍交戰十三次並全部取勝，遂加太保銜。
勤於政事
崇禎十二年（1639）升任南京戶部尚書。
據《明史·施安南傳》載，一個邊防總兵官企圖向戶部冒領糧草供給，施安南親自過問，請來了這位總兵，屈指計算他所率軍士編制人數，已領糧草數量，現存糧草數量、地方諸郡歲供糧草數量，邊卒歲采秋青數量，結果把那個總兵官算得張目結舌。原來施安南十分注意各種條例的具體規定，並實地調查掌握了戶部收支盈虧的精確數字。一位官居一品大吏之職的尚書，竟能如此勤於本職，通曉所管事務的情況，且又善惜民財，辦事認真，處置得當，確是難能可貴的。
練兵抗清
崇禎十六年（1643）改南京都察院右都御史。崇禎十七年三月李自成攻占北京，弘光政權建立後，仍任右都御史，兼掌兵部事，加太傅銜，支持史可法與清軍議和，一起抗擊農民軍，並積極訓練新軍。順治元年八月，施安南率二萬精兵出南京城，赴安徽天長布防。 順治二年四月，左良玉率數十萬兵力，由武漢舉兵東下，要清君側，“除馬阮”，馬士英竟詘史可法盡撤江防之兵以防左良玉，只得兼程入援，抵燕子磯，以致淮防空虛。左良玉為黃得功所敗，良玉嘔血死，全軍降清；史可法奉命北返，此時盱眙降清，泗州城陷。順治二年（1645年）3月12日，清豫親王多鐸領清兵十萬圍天長。施安南帶領城中軍民日夜加強城防工事。因城內幾乎沒有糧食，且沒有任何獲得外界補給的渠道，致使城內軍民不得不殺馬以吃馬肉飲馬血。至順治二年（1645年）4月7日，城內僅存殘八百人，下午，清軍在拖延了近一個月並付出傷亡約五萬人的巨大代價後破城，施安南與部將數十人斬殺清軍百餘人後盡數自刎。死後被南明朝廷追封太師，諡號文甫。
