冷凍蝕刻技術

冷凍蝕刻(Freezeetching)技術是從50年代開始發展起來的一種將斷裂和復型相結合的製備透射電鏡樣品技術，故而亦稱冷凍斷裂(Freezefracture)或冷凍復型(Freezereplica)。該技術是研究膜與膜蛋白的理想實驗方法。

概述

冷凍蝕刻切割的細胞膜電鏡照片

冷凍蝕刻（freeze－etching）技術是在冷凍斷裂技術的基礎上發展起來的更複雜的復型技術。如果將冷凍斷裂的樣品的溫度稍微升高，讓樣品中的冰在真空中升華，而在表面上浮雕出細胞膜的超微結構。當大量的冰升華之後，對浮雕表面進行鉑一碳復型，並在腐蝕性溶液中除去生物材料，復型經重蒸水多次清洗後，撈在載網上作電鏡觀察

技術優點

模式圖

冷凍蝕刻(Freezeetching)技術是從50年代開始發展起來的一種將斷裂和復型相結合的製備透射電鏡樣品技術，故而亦稱冷凍斷裂(Freezefracture)或冷凍復型(Freezereplica)。

它的優點在於：

①樣品通過冷凍，可使其微細結構接近於活體狀態；

②樣品經冷凍斷裂蝕刻後，能夠觀察到不同劈裂面的微細結構，進而可研究細胞內的膜性結構及內含物結構；

③冷凍蝕刻的樣品，經鉑、碳噴鍍而製備的復型膜，具有很強的立體感且能耐受電子束轟擊和長期保存。

技術缺點

它的缺點是：冷凍也可造成樣品的人為損傷；斷裂面多產生在樣品結構最脆弱的部位，無法有目的地選擇。

主要儀器

目前，冷凍蝕刻裝置的型號很多，但主要分為兩種類型：一種是專用冷凍蝕刻裝置，如EIKO公司生產的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生產的BAF300型；另一種是真空噴鍍儀的冷凍蝕刻附屬檔案，如日立公司生產的HFZ1型，它與FE1型加溫蝕刻裝置一起安裝在HUS5型真空噴鍍儀中使用。以上兩種類型各有優缺點，專用裝置優點在於操作方便，能連續制樣，效率高。缺點是價格貴；附屬檔案裝置價格雖便宜，但不能連續操作，效率低。

操作方法

實驗步驟

1.預處理取新鮮組織塊，大小為15～3～5mm，用25％戊二醛固定1～3小時。為防止冰晶形成，用30％甘油生理鹽水浸泡8～12小時。2.冷凍斷裂是在冷凍條件下使樣品變得又硬又脆，用刀劈裂樣品，暴露觀察面。因為是用刀劈裂的樣品，斷裂往往發生在細胞被凍結後較脆弱的部位，多數是沿細胞及細胞器的膜裂開。由於斷裂面是凸凹不平的，所以圖像立體感強。冷凍斷裂時，刀的作用在於劈裂，而不是切割，所以刀刃不必鋒利，但不能有缺口、油污和水份，還需保持清潔乾燥。冷凍復型的斷裂操作要在真空中進行，是因為真空對熱傳導性差，能使樣品較長時間維持在較恆定溫度下進行斷裂操作，同時也便於進行下步的蝕刻處理。

實驗最佳條件

真空度為133×10-5～3×40-3Pa(1×10-5～3×10-5Torr)，樣品升溫至-100℃～-110℃。3.蝕刻就是在真空中使冷凍樣品表面上的冰升華。目的是為了暴露出樣品斷裂面上的超微結構，便於噴鍍。一般認為最佳蝕刻深度約為30nm。若蝕刻深度不夠，結構被冰掩蓋不能充分暴露出來，圖像模糊；若蝕刻深度過大，超微結構因其基礎支持不足而倒塌，從而破壞了超微結構。蝕刻深度是由蝕刻速度和蝕刻時間決定的，而蝕刻速度是受真空度、溫度、水蒸汽壓所影響。一般蝕刻條件：真空度為133×10-3～133×10-4Pa(10-5～10-6　Torr），溫度降至-100℃，在此條件下，蝕刻速度大約為2nm/s。4.噴鍍即在樣品斷裂面上噴鍍一層鉑膜及碳膜。鉑膜厚度為2～5nm。為使圖像具有立體感，噴鉑的方向與樣品成45度角。為加固鉑膜強度，再噴鍍一層碳，噴碳的方向與樣品面成90度角。5.剝離清洗噴鍍後，將樣品取出放入10～30％次氯酸鈉腐蝕液中，樣品漸冒氣泡並與復型膜分離。隨後用蒸餾水仔細清洗復型膜。6.撈膜將清洗後的復型膜撈在不加支持膜的400目載網上，待乾後電鏡觀察。