發展簡史
——1941年Coons首先用螢光素標記抗體—檢測肺組織內的肺炎雙球菌獲得成功。
——60年代Nakane建立酶標抗體技術——鐵蛋白標記Ab技術。
——70年代Stemberger改良上述技術，建立辣根過氧化物酶——抗體過氧化物酶（PAP）技術，使免疫細胞化學得到廣泛套用。
——80年代Hsu等建立了抗生物素—生素（ABC）法之後，免疫金—銀染色法、半抗原標記法、免疫電鏡技術相繼問世。
——90年代分子雜交技術、原位雜交技術、免疫細胞化學分類方法迅速發展。
——2000年各種免疫組化技術更加成熟，使免疫組化技術成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的一項有力工具。其套用範圍深達醫學各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。
技術分類
（1）根據染色方式分成：①貼片染色②漂浮染色
（2）根據Ag—Ab結合方式分成：①直接法②間接法③多層法
（3）按標記物的性質分成：①免疫螢光技術（免疫螢光法）②免疫酶技術（酶標抗體法、橋法、PAD法、ABC法）③免疫金屬技術（免疫鐵蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）
標記物
（1）必要性：組織細胞內Ag—Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，則必須具有可視性標記物。
（2）常用標記物
①螢光素：最常用的是異硫一氰酸螢光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）——螢光顯微鏡下呈綠色螢光
四乙基羅達明（rho—damineRB200）——螢光顯微鏡下發橙紅色螢光
②酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶。
③生物素：（Biotin）
④鐵蛋白金等：主要套用於免疫電鏡。
其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）
免疫組化技術
染色方法
1．直接法
螢光素直接標記特異性抗體（—抗）上，標記抗體與抗原結合（在切片上）螢光顯微鏡下觀察→檢測抗原。
△酶標抗體要顯示後鏡檢。
直接法優點：簡單，時間短，特異性強。缺點：靈敏度低，所需抗體量大（不經濟）。套用：基本不用！
2．間接法螢光素標記在二抗上（二抗：抗產生一抗動物的IgG抗體）。
※顯色後鏡檢
特點：較直接法靈敏，可標記一種抗體→鑑定多種抗原。
3．非標記Ab橋法：
“橋法”是酶標記抗體的改進，經過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。
（1）單橋法
(2)雙橋法
在三抗之後，將二抗和三抗再重複一次，
可增大染色強度。
★特別提示：注意動物種屬關係
4．PAP法（過氧化物酶—抗過氧化物酶法Peroxidaseanti—peroxidasemethod，PAP法）
~是橋法的改良，既先形成PAP複合物→抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP複合物。
該法簡化了操作步驟，提高了靈敏度，所染標本可長期保存。
5．ABC法（親和素—生物素—過氧化物酶複合物法，Avidin—biotin—peroxidaseComplexmethod，ABC法）
Avidin：親和素，一種糖蛋白，其上有4個與生物素相結合的位點。
Biotin：生物素—維生素H，兩者親和力巨大，牢不可破。
ABC法與PAP法的區別是：以ABC複合物代替PAP複合物。
（1）ABC複合物的製備：
（2）ABC法反應原理
6．SP或SAP法（過氧化物酶標記的鏈霉卵白素或過氧化物酶標記的鹼性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidaseorstrepta-vidin/alkalinephosphatase）
※該法是ABC法基礎上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結合，而後再結合PO。
它有4個亞基可與生物素結合，靈敏特異，背景低，成本低。
現在還有plus盒。優點是：更簡便，放大倍數↑，等電點中性更適合組織。分子量小，穿透力↑。
7．蛋白A—金法（Protein—Agoldmethod）
~多用於電鏡
8．雙重組化染色法
套用雙重免疫組織化學激素可在同一張切片，同一細胞或亞細胞結構內同時顯示兩種不同的抗原。
9．免疫金—銀染色法
（Immunogold—silverstainingIGSS）
套用
凡是組織細胞內具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經遞質、細胞因子、受體、表面抗原等等均可用免疫組織化學方法顯示，因而目前在基礎與臨床科研中被廣泛套用。最近幾年，分子生物學研究異常活躍，但最終還要歸到形態上來。用免疫組織化學方法對所研究的大分子分子進行定位，進而深入研究其功能。
