westernblotting實驗試劑
1
30% 丙烯醯胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯醯胺
將30克丙烯醯胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯醯胺溶於總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。0.45μm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應不大於7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯醯胺具有很強的神經毒性並可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯醯胺和N,N’-亞甲丙烯醯胺時應戴手套和面具。可認為 聚丙烯醯胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。
2
4×Tris·Cl/SDS,pH8.8,
在300mlH2O中溶解91g Tris鹼（1.5mol/L），用1mol/L調節pH至8.8，補加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，於4℃可保存1月。
3
4×Tris·Cl/SDS,pH6.8,
在40mlH2O中溶解6.05g Tris鹼(0.5mol/L），用1mol/L調節pH至6.8，補加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，於4℃可保存1月。
4
4×SDS電泳緩衝液
Tris base 24.2 g
Glycerin 115.3 g
20%SDS 20 ml
加水至總體積1000ml。
套用時稀釋4倍即為1×SDS電泳緩衝液（Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%）。
5
TEMED (N,N,N’，N’-四甲基乙二胺）
TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯醯胺和N,N’-亞甲丙烯醯胺的聚合。
6
10%過硫酸銨
過硫酸銨提供驅動丙烯醯胺和亞甲丙烯醯胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配製小量10%(w/v）的貯存液並保存於4℃。由於過硫酸銨會緩慢分解，故應隔周新鮮配製。
步驟
1）按廠商的使用指南用兩塊乾淨的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，並固定在灌膠支架上。
2）按表7.1配製分離膠液體並脫氣，然後加入10%的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表7.1 聚丙烯醯胺分離膠的配製
試劑成分 配製不同濃度分離膠所需試劑（ml)
5% 8% 10% 12% 15%
Acry:Bis （30:0.8） 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
4×Tris·Cl/SDS,pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
按所需分離的 蛋白質分子大小選擇合適的丙烯醯胺百分比濃度，一般地，5%的 凝膠可用於60～200kDa的SDS變性蛋白質分子的分離，10%用於16～70kDa，15%用於12～45kDa。
3）用一根 巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入於玻璃平板夾層中，至凝膠約5cm高為止。樣品體積少於10μl不需灌制積層膠。
4）用另一根巴斯德吸管，先從一邊的墊片，再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加入一層水飽和異丁醇（厚約1cm）。讓凝膠在室溫聚合30min。
聚合後，可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線，膠的聚合失敗往往問題在於過硫酸按或TEMED，或兩者都有。
5）傾去頂層的 異丁醇，並以1×Tris-Cl/SDS,pH8.8緩衝液沖洗凝膠的頂部表面，儘量用吸水紙吸乾。
6）按表7.2配製積層膠液體，用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層，直至夾層的頂部。
表7.2 聚丙烯醯胺積層膠的配製
GEL%（3.9%) Total （10.05ml)
Acry:Bis（30:0.8） 1.30 ml
4×Tris·Cl/SDS,pH6.8 2.50 ml
H2O 6.10 ml
10%過硫酸銨 0.05 ml
TEMED 0.01 ml
7）將0.75mm厚的梳子插入夾層的積層膠液體中，必要時，再補加積層膠液體充盈剩餘空間。讓積層膠室溫聚合30min。
8）在具螺口蓋的微量離心管中，用2×SDS加樣緩衝液按1:1(v/v）稀釋待測蛋白質樣品，於100℃煮沸5-10min。如樣品是蛋白質沉澱物，加入50～100μl 1×SDS加樣緩衝液溶解之，並同樣在100℃煮沸5-10min。按供應商的使用指南用2×SDS加樣緩衝液溶解蛋白質分子量標準混合物。
對於0.3cm寬的加樣孔，推薦加樣體積以不超過20μl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯跡，成分很複雜的蛋白質混合物需加25～50μg，而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話，只需1～10μg蛋白量。採用銀染顯跡時，樣品用量可減小10～100倍（按樣品的複雜程度在小於20μl的體積溶有0.01～0.5ng蛋白樣品不等）。
2×SDS加樣緩衝液（loading buffer）配製：
成分 體積 (ml)
0.5M Tris·Cl (pH6.8） 12.5
20%SDS 11.5
Glycerin 10
2% Blue-Bromo-phenol 2.5
β-mercaptoethanol * 5.0
加H2O至總體積50 ml，分裝
*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。
9）小心拔出梳子，避免撕裂 聚丙烯醯胺凝膠加樣孔。取出梳子後，以1×SDS電泳電泳緩衝液沖洗加祥孔，並以此緩衝液充滿之。
10）按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩衝液室（上槽），同時往下緩衝液室（下槽）加入推薦量的1×SDS電泳緩衝液。
11）將固定於上槽的凝膠板放入下槽中，並往上槽加入部分電泳緩衝液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。
12）用帶平嘴針頭的50μl注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部成一薄層，對照孔加入蛋白質分子量標準樣品，如有空置的加樣孔，須加等體積的空白1×SDS樣品緩衝液，以防相鄰泳道樣品的擴散。
13）再往上槽加入餘下的1×SDS電泳緩衝液。此操作緩慢小心，以防衝起樣品孔中的樣品。
14）連線電源，對於0.75mm厚的垂直板電泳，先在60V下電泳至溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，再將電壓調至120V繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。
15）關閉電源並撤去連線的導線，棄去電泳緩衝液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。
16）將凝膠定位以便識別加樣的順序，將凝膠板從上槽解離出來，放在一疊吸水紙或紙巾上。
17）小心將封邊的墊片抽出一半，並以此為槓桿橇起上面的玻璃平板，使凝膠暴露出來。
18）小心從下面的玻璃平板上移出凝膠，在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及乾膠後仍能認出加樣次序，接著就可進行蛋白質的檢測。
19）轉膜
將凝膠面與負極相連， 硝酸纖維素膜與正極相連。（100V，1小時）要放於4℃。英文
⒈For transfer of proteins smaller than 20 kDa,transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent （250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer （25mM Tris,190mM glycine,20% MeOH).
⒉For transfer of proteins smaller than 120 kDa,transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent （250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer （25mM Tris,190mM glycine,20% MeOH).
⒊For proteins larger than 120kDa,transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent （250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS （25mM Tris,190mM glycine,20% MeOH,0.05% SDS).
⒋For Proteins larger than 250kDa,transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent （500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS （25mM Tris,190mM glycine,20% MeOH,0.05% SDS).
Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
20）、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。搖床搖動。（這步忘了！）
21）、封閉
⒈Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer （1% BSA,10mM Tris pH 7.5,100mM NaCl,0.1% Tween 20）.
⒉Incubate the blot for 1 hour at 37℃，2 hours at room temperature,or overnight at 4℃.
22）、一抗孵育
一抗用TBST1:1000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1.5小時，（或4℃過夜）搖床搖動。
Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available,use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000,apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
23）、清洗
將硝酸纖維素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分鐘。
24）、二抗孵育
二抗用TBST1:8000稀釋，將硝酸纖維素膜放入其中，37℃孵育1小時，搖床搖動。
25）、清洗
同22，之後，用1X TBS在清洗2次，每次5分鐘，以洗去膜上的Tween 20，因為它可以阻礙底物的沉積。
26）、顯色
按如下配方配製顯色液：
1mL水+1滴（大約50微升）試劑A（之後混勻）+1滴試劑B+1滴試劑C
將硝酸纖維素膜放入其中孵育，一旦顯色，立即放入去離子水中終止反應。
