G418

G418

G418(Geneticin,遺傳黴素) 是一種氨基糖苷類抗生素 ,在分子遺傳試驗中,是穩定轉染最常用的抗性篩選試劑。它通過抑制轉座子Tn601,Tn5 的基因,干擾核糖體功能而阻斷蛋白質合成,對原核和真核等細胞產生毒素 ,包括細菌、酵母、植物和哺乳動物細胞 ,也包括原生動物和蠕蟲。當neo基因被整合進真核細胞DNA後 ,則能啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA ,從而獲得抗性產物氨基糖苷磷酸轉移酶的高效表達 ,使細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長。G418的這一選擇特性 ,已在基因轉移、基因敲除、抗性篩選以及轉基因動物等方面得以廣泛套用。

簡介

G418通過干擾 核糖體的功能而阻斷細胞的蛋白合成

使用方法

室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存,溶於水、甲醇,溶液於-20℃儲存 由於各真核細胞系對G418敏感度不同,各新細胞系或株 穩定轉染時殺死非穩定轉染細胞所需用量需要通過實驗最佳化。最適用量通過建立細胞死亡曲線獲得。將細胞稀釋至1000cell/ml,每孔100ul加入有培養基的24孔板,將每孔中的G418濃度稀釋至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12個級別, 培養10-14天,以細胞全部死亡最低濃度為基準,一般400-800左右,篩選時比該濃度再高一個級別,維持時使用篩選濃度的一半即可。

濃度範圍

細胞系或機體 G418濃度(ug/ml)

中國倉鼠卵巢細胞700~800

Madin-Darby犬腎細胞 500

人上皮A431細胞 400

猿CV-1細胞 500

盤基網柄菌屬 10~35

植物 10

酵母125~500

質量指標

G418 :白色粉末,融點138~144℃,溶於水、甲醇。 CAS No.:108321-42-2

分子式 :C20H40N4O10 ?2H2SO4 分子量 :692.71

比鏇:+104o~+121o 水分:≤10% 吸光值:≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml)

效價: >700 ug/mg

[儲運] 室溫下運輸, 乾粉在室溫下儲存,溶液於-20℃儲存。

篩選

由於每種細胞對G418的敏感性不同,而且不同的廠家生產的相同濃度的G418的活性不盡相同,所以在篩選之前,一定要確定G418的最佳篩選濃度。具體如下:將細胞稀釋到1000個細胞/mL,在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度範圍內進行篩選,選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。

由於每種細胞對G418的敏感性不同,一般變動在100ug/ml~1000ug/ml範圍。在篩選之前,一定要確定細胞對這一批G418的最佳篩選濃度。儘管如此,特性明確的細胞系G418的最佳用量還是穩定的。《分子 克隆》給出了幾個常用細胞系所需G418的最佳用量。

由於 基因轉染到細胞內之後要一段時間才能表達出蛋白質。所以篩選不能太早;但是也不能太晚,因為轉染了外源基因的細胞 代謝負荷較大,增值較慢,時間長了就會被沒有外源基因轉入的細胞所淹沒,最終導致篩選不出 陽性克隆,一般要在轉染24小時之後才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都會下降,所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度可以降至200ug/ml。

加藥篩選約6天左右,細胞會大量死亡,孔中只剩下的細胞寥寥無幾。這時會出現兩個問題:1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質,導致那些有neo表達的陽性細胞死亡,即非選擇性死亡。2.孔中細胞數目很少,細胞之間的信號會變得很弱,也會導致陽性細胞的狀態不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養液:假如你要轉染3T3細胞,在3T3細胞匯合度達到80%的時候,換液,培養過夜之後收集培養液,通過濾器消毒,和新鮮的培養液按1:1混合備用。再轉染後篩選過程中就可以套用這種培養基。

為了儘量減少陰性 克隆的死亡給 陽性克隆造成的不利影響以及增加 陽性克隆的得率,可以套用套環法或刮除法結合 有限稀釋法來篩選陽性 克隆。加藥後,在高倍鏡下, 陽性克隆和陰性克隆很容易辨認,在陽性克隆下用記號筆做個標記。然後刮除陰性克隆,消化 陽性克隆後繼續篩選培養;或者用套環套住陽性克隆,在套環內加胰蛋白酶或EDTA消化,把消化液吸到另外一個新的孔中培養。最後再用 有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。

一般經過4周左右的篩選,得到的 陽性克隆都比較穩定。但是 外源基因如果沒有整合到基因組中的話,目的基因還是很容易丟失的。但是 外源基因整合到基因組中的 機率太小了,而且是隨機整合,會導致表達的目的蛋白的量產生很大差異。隨著培養時間的延續,那些丟失了 外源基因的細胞和很少表達目的基因的細胞會占據優勢,強表達目的蛋白的細胞會越來越少。這樣再次篩選是必不可少的。只有經過2次以上的篩選之後才能找到那種我們想要的強分泌目的蛋白的, 遺傳穩定的 細胞克隆。

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