藍藻病毒

定義

藍藻(Bule-green algae)是一類原核生物，具有細菌的一些特徵，因此又常稱為藍細菌(Cyanobacterium)，相應地，把感染藍細菌的病毒稱為噬藻體(Cyanophage)［1～2］，這是由於噬藻體與噬菌體非常相似的緣故。除藍藻外，所有其它的藻類均是真核生物，通常將感染真核藻類的病毒稱作“藻病毒”(Phycovirus)［3］，它們的絕大多數是多角體的粒子(Polyhedral particles)，只有個別如珊瑚輪藻(Chara corallina)病毒是桿狀的［4］。真核藻類病毒和病毒類粒子(VLPs)前文有過綜述［4］，藍藻病毒或噬藻體則完全不同於真核藻類的病毒，二者是藻類病毒的重要組成部分，藍藻病毒的研究情況有必要專門介紹。

其他概述

1　類型和性質
藻類病毒最先是在藍藻中發現的。1963年Safferman和Morris［5］在做藍藻的降解試驗時分離了一類病毒，它們同時侵染鞘絲藻(Lynbya)、席藻(Phormidium)及織線藻(Plectonema)，這類最早發現的病毒被命名為“LPP”病毒。以後陸續又發現了其它的藍藻病毒，其宿主在兩類藍藻(絲狀藍藻和單細胞藍藻)中均有分布，包括：(1)絲狀宿主，如顫藻(Oscillatoria)、項圈藻(Anabeanopsis)、簡胞藻(Cylindrospermum)、Raphidiopsis、魚腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)；(2)單細胞宿主，如微囊藻(Microcystis)、組囊藻(Anacystis)、聚球藻(Synechococcus)等。其中研究較多的有LPP型病毒、聚球藻病毒、念珠藻病毒等。
藍藻病毒的命名是根據宿主的名稱即取宿主的拉丁文的第一個字母，如上述提到的最先發現的“LPP”病毒［5］，後來分離的宿主為Anabaena(魚腥藻)的病毒，簡稱“A”病毒［6］，感染Nostoc(念珠藻)的“N”病毒［7］等。有的病毒感染“共專一宿主”(Cospecific host)，如同時侵染Anacystis(組囊藻)和Synechococcus(聚球藻)的病毒被命名為“AS”病毒［8］，同時侵染Synechococcus和Microcystis(微囊藻)的病毒命名為“SM”病毒［9］以及上述“LPP”病毒等；有的發現不同的血清學亞型，字母后加上阿拉伯數字來表示，如“SM-1”病毒、SM-2病毒及“LPP”系列等［10，11］(表1)。
　表1　主要藍藻病毒的形態特徵和理化性質
　Table 1 Morphological and biological characteristics of major cyanophages
主要參數 絲狀宿主 單細胞宿主
LPP-1 LPP-2 N1 SM1 S1 AS1-M
形態
衣殼特徵
形狀 二十面體 二十面體 六面體 二十面體 六面體 六面體
直徑 58.6±2 57.3±2 61.4±3 67±1.8 50 90±2
尾巴的性質
形狀 短、不能收縮 短、不能收縮 長、不能收縮 很短、有附絲 長、不能收縮 長、能收縮
長×寬(nm) 20×15 20×15 100×16 — 140×5(?) 240×20
類別 短尾病毒科 短尾病毒科 肌病毒科 短尾病毒科 Styloviridae 肌病毒科
對應的噬菌體 T7 T7 T-偶數 T7 λ T-偶數
生理特性
沉降係數 526～550 490 539 820 353 754
乾重(D) 53.4×104 50.9×104 未知 未知 未知 未知
CsCl浮力密度 1.48 1.48 1.498 1.48 1.501 1.49
對Mg2+的信賴 依賴(1mol/L) 依賴(1mol/L) 依賴 不依賴 依賴 不依賴
致失活溫度(℃) 55 55 　 55 　 55
穩定性
pH範圍 5～11 5～11 — 5～11 — 4～10
溫度範圍(℃) 4～40 4～40 — 4～40 — —
主要蛋白質(kD) 44.14 42.11 37.14 40.25 39.11 90.45
生長情況
潛伏期(h) 6 6 7 32 慢 8
溶解周期(h) 14 14 14 48 — 12
病毒效價(PFU/c) 200～350 200～350 100 — 50 —
DNA特性
分子量(D) 27×106 28×106 41～45×106 56～62×106 23～26×106 57×106
沉降係數 33 34.2 40.9 48 30.8 45.6
分子長度(μ) 13.2 — 20 24.3 13.3 29.5
CsCl浮力密度 1.714 1.709 1.696 1.725 1.729 1.714
G+C含量(%) 53 52 37～41 66 70～74 52～55
根據藍藻病毒的形態不同，國際病毒學分類委員會(ICTV)細菌病毒分會參照噬菌體的分類方式，將藍藻病毒分為三個科［12］：
(1)肌病毒科(Myoviridae)，特徵是含有一條中央管和能伸縮的尾巴。常見的有：AS-1，N-1，A-1(L)，A-2等；
(2)Styloviridae，特徵是含有長的、不能伸縮的尾巴。常見的有：S-1，S-2L，SM-2等；
(3)短尾病毒科(Podoviridae)，其尾巴較短。常見的有：LPP-1，LPP-2，SM-1，A-4(L)，AC-1等。
上面已經提到，藍藻有絲狀和單細胞兩種基本形態，由於病毒在這兩類藍藻細胞中的感染和複製明顯不同，因此藍藻病毒通常也有兩類，即絲狀藍藻病毒和單細胞藍藻病毒，前者常見的有：“LPP”型(宿為主Lynbya、Phormidium和Plectonema)、“N”型(宿主為Nostoc)、“A”型(宿為主Anabaena)等；後者包括：“SM”型(宿主為Synechococcus和Microcystis)、“AS”型(宿主為Anacysttis和Synechococcus)及“S”型(宿主為Synechococcus)等。它們的形態特徵和理化性質歸納於表1中［13］。
2　感染和複製
如上所述，藍藻病毒對絲狀宿主和單細胞宿主的感染是完全不同的，其原因是兩類藍藻細胞的新陳代謝差異很大，故病毒的感染和複製差異也很大［8］，如絲狀藍藻被病毒感染後，細胞超微結構迅速遭到破壞，且CO2的固定被封鎖；而單細胞藍藻受到病毒感染後，細胞的超微結構並不發生顯著的改變，CO2的固定也並不受到影響；此外，病毒在兩類宿主中複製的部位也不同，感染後，絲狀宿主的細胞中很快產生一種由類囊體內陷形成的結構，即所謂的“病毒生長基質空間”(Virogenic stroma space)，該部位將成為病毒繁殖的場所。這種結構在單細胞藍藻中並不形成，而病毒的複製則在核質中完成。不僅如此，這兩類病毒的生活史和複製周期也十分懸殊，絲狀藍藻病毒一般在3～5h內完成感染並釋放出大量的病毒粒子，而單細胞藍藻病毒的複製時間則長得多［13］。以下介紹這方面的情況。
2.1　對單細胞藍藻的感染
AS1-M感染雪松聚球藻(Synechococcus cedrorum)的一步生長曲線的基本特徵是：開始有3h的靜止期和隨後6～8h的潛伏期，至第12小時時宿主細胞裂解。病毒釋放量為40～55PFU/mL
［14］。
AS-1的生長情況相同，只是時間稍長。
另一類單細胞藍藻病毒SM-1的生長速度要慢得多，潛伏期高達32h，隨後的上升期為16h，細胞裂解時病毒的釋放量為100PFU/mL［15］。
AS1-M接觸到宿主的細胞壁後，利用尾巴的收縮將DNA注射進細胞，即開始合成自身的早期蛋白質，其中一種是DNase，感染後2h DNase降解掉宿主的DNA；另一種早期蛋白質是啟動病毒中期蛋白酶的合成，這些中期蛋白酶有許多功能，最重要的功能是合成病毒的DNA，另一個重要功能是啟動病毒後期蛋白質即結構蛋白的合成。大約在感染後4～6h，病毒的頭部形成，裝入病毒
DNA，並將尾巴連線到衣殼上。整個過程完成後，細胞裂解，病毒釋放［14］。
病毒對單細胞藍藻的感染並不引起宿主細胞的超微結構的變化，不影響CO2的固定，例如AS1-M在感染後8h，宿主CO2的固定、O2的釋放、光系統Ⅰ及光系統Ⅱ的活性與對照組相比，仍然保持80%的水平［14］。
2.2　對絲狀藍藻的感染
病毒對絲狀藍藻的感染最明顯的影響是抑制宿主的CO2的固定［16］。在形態上，病毒的早期侵染造成類囊體光合片層內陷，使片層與質膜之間形成一種特殊的“病毒生長基質空間”，病毒就在該部位繁殖。類囊體光合片層內陷的同時，宿主的DNA被降解，CO2的固定也被徹底封鎖，內含物滲漏出細胞。LPP-1侵染鮑氏織線藻(P.boryanum)後就立刻中止宿主所有大分子的合成，降解掉宿主DNA和蛋白質，大約2.5～3h後，病毒利用宿主提供的ATP和各種酶，開始合成自身所需要的蛋白酶，並利用宿主的降解產物合成病毒的DNA和蛋白質。感染後4h，病毒的頭部開始形成，感染後7h，在80%的宿主細胞中早期形成的“病毒生長基質空間”內擠滿了成熟的病毒粒子［10，17］。
需要提到的是，LPP型病毒是極烈性的病毒，同時也是一類較少依賴環境的病毒，這也許能夠解釋，在差異甚大的各種水體中，LPP型病毒均有廣泛的分布［13，17］。
3　分子生物學
雖然藍藻病毒的發現已三十餘年，但一直未形成病毒學重要的研究方向，近年來由於富營養化程度加劇，藍藻“水華”(俗稱“湖靛”)的發生加重，美國和西歐一些已開發國家加強了藻類環境生物學的研究力度，其中包括藍藻病毒的基礎研究，以尋找對付“水華”的生物防治方法。這幾年藍藻病毒的研究主要集中在分子生物學和生態學方面［18，19］，同時也在不斷探索更先進、更便捷的研究方法［19，20］。
分子生物學一直是藍藻病毒的主要研究方向之一。最先對LPP-1的核酸、蛋白質進行了較深入的研究，至九十年代大多數研究是有關聚球藻病毒的。聚球藻是由2～4個單細胞組成、結構簡單、易於培養的藍藻，不僅在淡水水體中生長，在海水中也廣泛分布，因此是研究病毒感染的理想宿主［21～23］。
淡水中的藍藻病毒研究較多，海水中的藍藻病毒研究十分有限，總之分子生物學研究深度還不夠。迄今對聚球藻(單細胞藍藻)和念珠藻(絲狀藍藻)的病毒報導較多［19，24～26］。Wilson等［27］分離得到5個感染Synechococcus sp. WH 7803品系的病毒，分屬於肌病毒科和Styloviridae，它們的基因組和結構蛋白有很大的差異，通過內切酶圖譜分析，肌病毒科病毒的基因組大小為80～85kb，Styloviridae病毒的基因組90～100kb；經CsCl密度梯度離心後用SDS-PAGE分析病毒多肽，發現兩類病毒結構蛋白儘管大小均為53～54kD，但是多肽結構和胺基酸組成大不相同。此外，將兩類病毒的DNA用幾種內切酶如HindⅢ、MluⅠ、Xho1、Sau3A、SmaⅠ和PvuⅡ作用後發現，它們的DNA受到宿主不同程度的修飾。值得注意的是，EcoRⅠ消化病毒DNA後，DNA有不同程度的甲基化。Park等［19］對同樣宿主的病毒核酸用各種酶消化，發現該雙鏈DNA基因組大小約為227kb，是已知的最大的藍藻病毒核酸，因而該病毒也具有最大的頭部(90nm)。
英國Lancaster大學的Bancroft［28］等人對絲狀藍藻的病毒進行了細緻的研究，他們建立了五株共同宿主為多變魚腥藻(Anabaena variabilis)病毒的限制內切酶圖譜。他們為繪製圖譜準備了這五株病毒的克隆DNA，由於病毒對Na+特別敏感，加上提取的DNA極易附著在細胞碎片上，使得天然DNA的提取得率很低，所以他們使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切病毒DNA，並將其片段連線到pBR322上，用此方法獲得病毒的克隆DNA。這些克隆DNA的限制性內切酶圖譜表明，兩對病毒AN-13與AN-23、A-1L與AN-10分別有很近的親緣關係，A-1L與AN-10病毒均含有67kb大小的環狀DNA，AN-13與AN-23病毒含有67kb大小的線形DNA，而另外一組病毒A-4L則含大小約40kb的線形DNA。他們認為這些數據能有效區分病毒、反映彼此的親緣關係與進化特徵。
多數藍藻病毒是裂解性的，但是也有少數是非裂解性或溫和性的，如LPP-ID和LPP-2SP1溶源性的原理還不很清楚，紫外線、X射線及絲裂黴素C均不能誘導裂解的發生［29～31］。但是溫度達到40℃時可對溶源性進行誘導，光對誘導也是需要的［14，22］。此外，溶源性病毒對別的病毒“超級感染”有免疫力［24］。
Suttle等人重點對藍藻病毒的研究技術進行探討，他們提到的方法有：電鏡技術(TEM)、噬斑技術(PFU)、超濾及超速離心技術等［20，32］。分子生物學的技術手段和限制性酶切圖譜、PCR和噬斑雜交(Plaque hybridization)等也套用於噬藻體的研究［19，33，34］。Suttle等人［20］最近建立了一種不用濃縮病毒即可直接計數的表面螢光顯微術(Epifluorescence microscopy)，比較了該方法與透射電鏡技術的優劣，例如用於病毒計數比透射電鏡的精確度高出25%。通過大量的實踐，他們認為，技術的綜合套用將大大提高研究藍藻病毒及其同宿主關係的廣度和深度。
4　生態影響
噬藻體的生態地位正在被重新認識，比較一致的是，藻類病毒被認為是水體微型生物群落系統中重要的動態因子，已觀察到其晝夜間數量的快速增減，說明它們在不斷地進入和退出該系統［35］。由於病毒的專性寄生，對宿主的種群密度起到調控作用，它們對藍藻的致死率達到72%［36］。儘管在生態學上還難以解釋病毒的調控機制，但不少現象如“水華”與“赤潮”的消長過程，病毒濃度和效價相應地發生明顯的變化［21，23，34，37］，病毒直接影響宿主的種群密度乃至存亡［4］。
由於我國經濟的發展，近年來人類活動增加，水體富營養化程度和藍藻“水華”發生日益嚴重，已經躍居世界前列，“水華”的防治尤其生物防治顯得十分緊迫，藍藻病毒的基礎研究在我國還相當薄弱，需要藻類學和病毒學方面的研究人員加強合作，共同努力，把具有良好套用前景的藻類病毒學這一新型學科開展起來，並逐步提高我國的研究水平。