腺病毒包裝技術

腺病毒表達系統中的難點主要在於怎么將外源基因表達框或者外源的shRNA表達框構建至腺病毒骨架載體上。由於腺病毒骨架載體比較大(~30kb),而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個,如果用常規的酶切-連線的方式將外源基因或者shRNA表達框構建至腺病毒骨架載體上,成功率很低,因此,目前的腺病毒表達系統基本上都是用同源重組的方法將外源基因或shRNA表達框構建至腺病毒骨架載體上。

簡介

腺病毒(Adenovirus)是目前最高效可靠的重組病毒表達系統之一,可用於在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。其具備以下優點:
1. 宿主範圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞,除可感染幾乎所有人的細胞類型外,還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
2. 因腺病毒的感染不依賴細胞周期,故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞
3. 腺病毒具有嗜上皮細胞特性,因目前大多數腫瘤細胞均屬於上皮細胞,這使得腺病毒非常適合套用於基因治療領域。
4. 病毒滴度高,可用於動物水平的實驗。
5. 有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中;實驗中雖然會有一定機率出現RCA(即複製型腺病毒),但由於大多數成人體內都有針對腺病毒的抗體,所以一般危害不大。

腺病毒包裝技術要點

重組腺病毒的包裝製備:重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位(PFU)中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質粒轉染後在20×15 cm板上由293A細胞連續侵染後被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化,並測定滴度及進行PCR鑑定。純化後重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml,獲得的量為2-4 ml。
重組腺病毒的特性:一般的,單個腺病毒通常是在30×150mm細胞培養皿中製備的。
獲得量:1×10病毒顆粒/細胞
滴定濃度:1×1010~1×1012個病毒基因組/ml
最終體積:1 ml純化後的病毒液(儲存於PBS)
儲存:批量儲存的最佳條件為-80°C
表一 腺病毒表達系統與慢病毒表達系統的比較

病毒表達系統 腺病毒表達系統 慢病毒表達系統
病毒基因組 雙鏈DNA病毒 RNA病毒
複製 自主複製 自主複製
感染細胞類型 感染分裂和不分裂細胞;
嗜上皮細胞(大多數腫瘤細胞均為上皮細胞)
感染分裂和不分裂細胞,適合難轉染的原代細胞(如神經細胞)及體內實驗
表達方式 瞬時表達 長時間、穩定表達
表達時間 快(1~2天) 慢(1~3天)
表達豐度 高水平表達 中水平表達
滴度 高達10~10 pfu/ml 最高可達10~10 pfu/ml
克隆容量 8~40 kb 8 kb
免疫原性 高免疫原性 低免疫原性
生物安全性 不整合;有一定機率出現RCA;大多數成人有抗體 整合;有一定機率出現RCL

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