無縫克隆

無縫克隆

無縫克隆(Seamless Cloning/In-Fusion Cloning),區別於傳統PCR產物克隆,唯一的差異在於載體末端和引物末端應具有15-20個同源鹼基,由此得到的PCR產物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的鹼基,依靠鹼基間作用力互補配對成環,無需酶連即可直接用於轉化宿主菌,進入宿主菌中的線性質粒(環狀)依靠自身酶系將缺口修復。

技術原理

基因克隆的引物設計及目的DNA片段的擴增,與常規PCR法是相同的。唯一的差異在於載體末端和引物末端應具有15-20個同源鹼基,由此得到的PCR產物兩端便分別帶上了15-20個與載體序列同源性的鹼基。通過相關酶試劑處理,同時除去載體與目的DNA上同源片段的雙鏈中的一條鏈,這樣載體和目的DNA兩端就露出了能夠互補配對的序列,依靠同源序列鹼基間的配對能使載體和目的DNA較為緊密的連在一起而無需酶聯,直接用於轉化。

過程

無縫克隆 無縫克隆

技術特點

傳統的PCR產物克隆方法主要有兩種:一種是PCR引物設計時引入載體上的酶切位點,PCR產物經雙酶切後定向克隆到目的載體上;另一種是TA載體連線。這兩種方法費時費力,過程繁冗。

無縫克隆和組裝技術是一種新的、快速、簡潔的克隆方法,旨在克服上述缺陷,它可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA的片斷的插入,而不需要任何限制性內切酶和連線酶。突破傳統的雙酶切再加上連線,只需要一步重組法,即可得到高效率克隆的重組載體。

1、位點選擇靈活:載體任意位置基因克隆;

2、快速簡便:省略酶切、割膠回收、酶連等過程,大約1h完成載體構建;

3、精確:不需要增加任何額外的程式;

4、克隆效率高,陽性克隆高達90%以上;

5、一次進行多片段目的基因的重組;

引物設計方法

無縫克隆 無縫克隆

操作過程

1.採用酶切或者PCR擴增方法將載體線性化;

2、使用設計好的引物進行目的DNA片段的PCR擴增

3、將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到試管中進行重組反應:

buffer-enzym(mix) 15 uL

線性化載體 X uL

PCR片段 Y uL

ddH2O W uL

Total 20uL

4、混勻後在PCR儀中適當溫度孵育30-60min,然後轉移至冰上;

5、克隆產物直接轉化宿主菌,塗平板挑選出陽性克隆子。

套用:

1、片斷克隆,片斷組裝,突變構建;2、基因表達,成膜,小RNA等功能研究;3、蛋白質突變研究;4、套用合成生物學;5、代謝工程,菌株改造。

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