離子交換層析法

離子交換層析法

離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相,利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。

離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相,利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。

基本原理

離子交換層析法 (ion exchange chromatography,簡稱IEC)是從複雜的混合物中,分離性質相似大分子的方法之一,依據的原理是物質的酸鹼性極性,也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質,對管柱上的離子交換劑有不同的親和力,改變沖洗液的離子強度pH值,物質就能依次從層析柱中分離出來。
離子交換層析法大致分為5個步驟:
1. 離子擴散到樹脂表面。
2. 離子通過樹脂擴散到交換位置。
3. 在交換位置進行離子交換;被交換的分子所帶電荷愈多,它與樹脂的結合愈緊密,也就愈不容易被其它離子取代。
4. 被交換的離子擴散到樹脂表面。
5. 沖洗液通過,被交換的離子擴散到外部溶液中。
離子交換樹脂的交換反應是可逆的,遵循化學平衡的規律,定量的混合物通過管柱時,離子不斷被交換,濃度逐漸降低,幾乎全部都能被吸附在樹脂上;在沖洗的過程中,由於連續添加新的交換溶液,所以會朝正反應方向移動,因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。
如果被純化的物質是胺基酸類的分子,則分子上的淨電荷取決於胺基酸的等電點和溶液的pH值,所以當溶液的pH 值較低,胺基酸分子帶正電荷,它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上;隨著通過的緩衝液pH逐漸增加,胺基酸將逐漸失去正電荷,結合力減弱,最後被洗下來。由於不同的胺基酸等電點不同,這些胺基酸將依次被洗出,最先被洗出的是酸性胺基酸,如apartic acid和glutamic acid(在約pH3~4時),隨後是中性胺基酸,如glycine和alanine。鹼性胺基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩衝液中仍帶有正電荷,因此這些在約pH值高達10~11時才出現。

(圖)離子交換層析法離子交換層析法

樹脂材質

最常見的離子交換樹脂材質是聚苯乙烯-苯二乙烯(polystyrenedivinylbenzene),它是由苯乙烯(styrene)和苯二乙烯(divinylbenzene)聚合產生的三維網狀結構,舉例來說,Dow化學公司所生產的樹脂Dowex 50×8,表示含8%苯二乙烯。
根據交換樹脂的性能,分為陽離子陰離子交換樹脂。
1. 陽離子交換樹脂
分為強酸型中強酸型弱酸型三類,強酸型樹脂含有-R-SO3H,中強酸型樹脂含有-PO3H2、-PO2H2或-O-PO2H2,弱酸型樹脂含有-COOH或-OH。 陽離子交換樹脂進行的反應如下:

(圖)離子交換層析法離子交換層析法

2. 陰離子交換樹脂
分為強鹼型中強鹼型弱鹼型三類,含有銨鹽四級銨鹽 [ -N+(CH3)3] 為強鹼型樹脂,三級以下銨鹽 [-N(CH3)2]、[ -NHCH3]、[ -NH2] 都屬弱鹼型樹脂;同時具有強鹼和弱鹼型基團的,為中強鹼型的樹脂。陰離子交換樹脂進行的反應如下:

(圖)離子交換層析法離子交換層析法

除了樹脂以外,纖維素(cellulose)、 葡聚糖凝膠(Sephadex gel)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)也是常用的離子交換材質,特性是具有親水性和較大的表面積,對生物活性物質而言,是一個較為溫和的環境,同時也是大分子所適用的分離純化材質 。常用的種類如下:

(圖)離子交換層析法離子交換層析法

實驗證明,纖維材質蛋白質核酸的分離純化效果相當好,因為離子交換纖維的種類多,能依據不同分離目的使用,且功能團基主要在表面,對生物大分子的交換十分有利。

離子交換劑的選擇

離子交換劑的選擇,首重保持欲分離物質的生物活性,以及在不同pH值環境中,此物質所帶的電荷電性強弱。
1. 陰陽離子交換劑的選擇
若被分離物質帶正電荷,例如polymyxin、 cytochrome C這些鹼性蛋白質,它們在酸性溶液中較穩定,親和力強,故採用陽離子交換劑;其它像heparin、nucleic acid這類酸性物質,在鹼性溶液中較穩定,則使用陰離子交換劑;如果欲分離的物質是兩性離子,一般考慮在它穩定的pH範圍帶有何種電荷,作為交換劑的選擇。以胰島素(insulin)為例,它的等電點為pH 5.3,因此在pH<5.3(酸性)溶液中,採用陽離子交換劑,在pH>5.3的鹼性溶液中,使用陰離子交換劑。
簡言之,已知等電點的物質,在高於等電點的pH條件下,因帶有負電荷,應採用陰離子交換,在低於等電點的pH下,則採用陽離子交換。未知等電點的物質,在一定pH條件下進行電泳,向陽極移動較快的物質,在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附,向陰極移動較快的物質可被陽離子交換劑吸附。
2. 緩衝液的選擇
緩衝液酸鹼度的選擇,決定於被分離物質的等電點穩定性溶解度和交換劑離子的pK值。使用陰離子交換纖維時要選用低於pK值的緩衝液,若欲分離的物質屬於酸性,則緩衝液的pH值要高於該物的等電點;用陽離子交換纖維時要選用高於 pK值的緩衝液,目的物屬於鹼性物質的話,緩衝液要低於該物等電點的pH值。
緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉澱為原則,如使用UV吸收法測樣品,那么pyridine或barbital這類會吸收UV的物質就不適用。

離子交換樹脂的前處理

離子交換樹脂使用前,先以蒸餾水除去其內之雜質 ,並以NaOH和HCl處理樹脂,使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹脂先以15倍於樹脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘,再以水清洗至pH 7.0,之後用0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘,同樣以水清洗至pH 7.0,最後用欲使用的緩衝液浸泡。陽離子交換樹脂用15倍於樹脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘,以水清洗至pH 7.0,之後用0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘,再以水清洗至pH 7.0,最後用欲使用的緩衝液浸泡。

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