陽離子交換層析實驗方法
離子交換過程陽離子交換層析實驗方法
陰離子交換劑與陽離子交換劑的裝柱和層析過程基本相同。交聯葡聚糖的預處理只需充分溶脹和平衡，不需要除去細粒碎片和酸鹼處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。
1. 劑型的選擇
根據蛋白質在所用緩衝液pH值下帶電荷的種類選擇，如pH高於蛋白質等電點，應選陰離子交換劑，反之應選陽離子交換劑。一般情況下，DEAE-纖維素用於分離酸性蛋白，而CM纖維素用於分離鹼性蛋白質。
下面以DEAE-纖維素操作為例，介紹試驗方法
2. 膨脹活化
此步的目的在於除去雜質，暴露DEAE-纖維素上的極性基團。DEAE-纖維素的用量則根據柱容積的大小和所需過柱樣品的量來決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當於6ml～8ml柱床體積。
表1－4 分離的血清與所需DEAE—纖維素量及其他條件的大致關係
血清樣品量（ml）
DEAE需用量（g）
選層析柱規格（cm）
選脫液量（ml）
1-2
2
1×25
100-150
5
5
2×12
200-300
10
10
2×20
300-400
20
20
2×37
400-800
稱取所需的量，撒於0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纖維素乾粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將纖維素浸泡於0.5Mol/L HCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸於0.5Mol/L NaOH液中，同樣處理，洗至中性。
3. 平衡
將DEAE—纖維素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始緩衝液），靜止1h，不時攪拌，待纖維素下沉後，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反覆幾次至傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時為止。
4. 裝柱
層析柱的選擇要大小、長度適當。一般而言，柱長和柱直徑之比為10∶1-20∶1，柱的內徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內浸泡處理24h，然後依次用常水、蒸餾水、起始緩衝液充分洗滌。
裝柱時，先剪一塊圓形的尼龍紗布（直徑與層析柱內徑一致），放入層析柱底部。將柱下端連線細塑膠管，夾上螺鏇夾。把層析柱垂直固定在三角鐵架上，倒入起始緩衝液至一半的柱高，除去死區及塑膠管內的氣泡。再將平衡的DEAE－纖維素糊狀物沿管壁倒入柱中。注意不要產生氣泡，如有氣泡應排除或重裝。擰開螺鏇夾，使流速至1ml/5min，待緩衝液快接近纖維素麵時，繼續倒入纖維素糊，同時用玻璃棒攪拌表面層，以免使兩次加入的纖維素形成分界層，通過進出緩衝液調節流量，也可通過塑膠管的升降來控制，至柱床體積不變為止。剪一圓形濾紙（與柱內徑大小一致），從柱的上端輕輕放入，使其沉接於纖維素床表面，以免在加樣時打亂纖維素層。裝好柱的柱面應該是平整的，無傾斜，整個柱床內無氣泡、不分層。繼續平衡，使流出液的pH值與流入液的pH值完全一致為止。
5. 上樣
要層析的樣品首先必須用起始緩衝液（4℃）平衡過夜，中間可換液數次。將柱的上端打開，用吸管將纖維素柱上面的緩衝液吸出，不要吸淨，留一薄層液面，以免空氣進入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開下端的螺鏇夾，使樣品進入交換劑中，快要進完時，加1ml-2ml緩衝液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
樣品的加量與DEAE-纖維素有一個最適比的關係，超過這個比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經過粗提的—球蛋白50mg-100mg，用乾重約4g DEAE-纖維素裝柱分離，可獲得理想結果。
離子交換劑的類型
1．聚苯乙烯陽離子和陰離子交換樹脂
這是最重要一類離子交換樹脂，由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作為骨架，在引入所需要的酸性基或鹼性基而成。根據引入的可離解基團的性質又可分為下列兩類離子交換樹脂：
1)聚苯乙烯陽離子交換樹脂 這類交換劑可再分為強酸型、中強酸型及弱酸性三種；2）聚苯乙烯陰離子交換樹脂也可在分為強酸性、中強酸性及弱酸性三類。
2．聚丙烯酸陽離子交換樹脂是由甲基丙烯酸和二乙烯的聚合而成。這類樹脂具高度的交換量，每棵樹脂可交換10毫克當量物質。這種高度締合的非離子化羧基使樹脂的表面形成一個親水平，對極性分子能起一種很有效的吸附作用。
3． 其它離子交換劑
1）選擇性離子交換劑是利用某些特殊的有機溶劑可與某些金屬離子起選擇性反應的原理而製備的。如用含汞的樹脂分離含巰基的化合物（輔酶A，半胱氨酸，谷胱甘肽）。
2）吸附樹脂 是一類有很大的表面積，吸附能力強，離子交換的能力很小的樹脂。主要用於脫色和除去蛋白質等，也成為“脫色樹脂”。
3）電子交換樹脂 這類所交換的不是離子而是電子，交換反應是個氧化還原反應，也稱“氧化還原樹脂”。
