金黃色葡萄球菌A蛋白

金黃色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA）是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質。早在1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉澱。Jensen也發現類似現象，並將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了該抗原，並證明它是一種蛋白質。為與A與糖相區別，Grov將其命名為金黃色葡萄球菌A蛋白，簡稱SPA或蛋白A。由於SPA的一些免疫特性，它已引起廣大免疫學者的興趣，並發展成為免疫學上一種極為有用的工具。

研究概述

金黃色葡萄球菌A蛋白

分析：金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金（SPA-CG）分子的特徵性構象特點，探討其作為原子力顯微鏡觀測原位標記物的可行性。

方法：套用原子力顯微鏡掃描生理狀態下分布在雲母表面的金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金分子，並進行結構分析及理論計算。

結果：極少數平臥的SPA-CG呈中部球形隆起，兩端長短不一的彎曲棒狀肽鏈環抱球形隆起的獨特結構，形成反“C”字形結構，球形隆起直徑為單個膠體金直徑的3～4倍；極少數SPA-CG呈逗號樣；絕大多數SPA-CG呈一側面稍凹的橢球形結構，結構穩定、均一，長徑為（40．88±1．58）nm，寬徑為（20．82±0．68）n，高度（Z軸）為（10．51±0．28）nm。

結論：單個膠體金標記的金黃色葡萄球菌A蛋白分子具有獨特、穩定、均一的特徵性構象，可作為原子力顯微術觀測的原位標記物。

性質特點

臨床常見葡萄球菌菌種

(1)SPA存在於大多數金黃色葡萄球菌中，而不存在於表皮葡萄球菌中。並且主要存在於血漿凝固酶陽性菌株，而不存在於陰性菌株中。前者是致病的，後者是非致病的，但在體內研究中尚未發現SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關係。不同菌株間的SPA含量有明顯差異，以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和細胞壁的肽聚糖呈共價結合。抗二甲氧基苯青黴素突變株能產生分泌性SPA，它較之細胞壁所含的SPA在免疫學性質上相似，但易分離，損失少。

(2)SPA為蛋白質成分，僅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而異，用脫氧核糖核酸酶消化細胞壁後超速離心或用加熱油提法，所測分子量為12000～15000。用沉澱平衡分析和在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽中凝膠過濾，測出分子量為42000。SPA為多肽單鏈，內含3個高度相似的Fc段結合區，每區由50個以上的胺基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定。SPA粘度高於球蛋白，等電點為pH5.1，其天然結構十分穩定，在套用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級結構，如將此變性劑除去，則能自然矯正而恢復原有結構。

(3)SPA之所以引起免疫學家的重視，是因為它具有的免疫學特性。SPA具有和人與許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結合的能力。SPA結合部位是Fc段而不是Fab段，這種結合不會影響抗體的活性。SPA具有的結合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如螢光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。還有一個饒有興趣的事實是，和SPA結合後的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽等使之解離。SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG1、IgG2、和IgG4有結合力，唯獨不結合IgG3。只結合IgA2，而不結合IgA1。SPA和禽類血清IgG不結合。

(4)SPA具有多種生物學作用，如引起豚鼠解離體迴腸和收縮，在吞噬反應中抑制IgG調理素吞噬和殺菌作用，SPA—Igg 複合物能固定人的補體和人、狗、豬的新鮮補體，對人類B細胞具有促有絲分裂因子的作用等。

套用介紹

凝固酶陰性葡萄球菌

套用SPA建立了許多敏感、特異性強、快速和簡易的實驗方法，並在許多方面的套用中積累了實際套用的材料，現已廣泛套用到免疫學及其相關科學如細胞學、細菌學和病毒學等。其可能套用的範圍可歸納為以下四個方面：

1.套用於免疫球蛋白的製備和分析 SPA是一種比較理想的提純和分析免疫球蛋白的試劑。由於SPA與IgG及其某些亞型的Fc段有較強的結合力，可利用來提純、分析免疫球蛋白製劑，結合後的PSA—IgG可再用解離劑如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸鹽或6mol/L的鳥嘌呤鹽酸鹽使之解離，多用SPA—Sepharose 層析柱分離IgG或其亞型及斷片如Fc、Fab等。

2.套用於免疫細胞化學 由於SPA具有雙價結合力，在免疫細胞化學技術中可作為橋抗體或標記抗體。由於SPA能與多種動物的IgG的Fc段結合，因此，作為第二抗體或標記抗體，SPA的最大優點是不受種屬特異性的限制，故在目前各種免疫細胞化學技術中已得到廣泛的套用。除不受種屬限制這一特點外，SPA法還具有染色時間短、靈敏性高和背景染色淡等優點。據報告用國產酶聯SPA代替酶標記抗體，套用間接染色，時間較PAP法省時一半。SPA分子量小，易於穿透組織，而免疫球蛋白酶標記抗體為200000，PAP複合物為430000，均較SPA分子量大。

3.套用於多種細菌、支原體和病毒等病原體的簡易快速診斷可套用SPA菌體作為載體，結合特異性抗體成為一種吸附原，作協同凝集劑，用於某些細菌和病毒的定群和分型。

4.可作為一種研究免疫複合物、膜抗原、膜受體和膜Ig的固相吸附劑 Hallgsen用同位素標記SPA測定血IgG的凝集物，發現85%全身性紅斑狼瘡和42%類風濕病人血清中凝集物增高。SPA用於細胞膜抗原、表面IgG和Fc受體的研究最大特點是能研究活細菌。Ghetie用SPA致敏綿羊紅血球，與經IgG處理的細胞形成玫瑰花環，來鑑定帶Fc受體的細胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花環形成，則可定量測定細胞表面的IgG。套用SPA與膠體金或鐵蛋白相結合，可在電鏡水平檢查抗原抗體反應的定位。特別是蛋白A—膠體金技術自Pomano和Romano首次報告用於標記細胞表面抗原、包括淋巴細胞、血小板、大鼠腎臟細胞及感染的病毒細胞獲得成功以後，已得到愈來愈廣泛的套用，是一種較為理想的免疫電鏡技術。

SPA在免疫細胞化學染色中的套用

葡萄球菌（革蘭染色片）

SPA可為多種示蹤物如螢光素、酶、膠體金、鐵蛋白等所標記，套用較廣的為酶標記SPA和金標記SPA技術，後者將在第七章 中敘述。標記SPA常用的酶為HRP。可套用於間接法。SPA在PAP法中可代替橋抗體。

1.SPA—HRP用於間接法的操作步驟

(1)切片經脫蠟後用0.5%H2O2—純甲醇液處理5min以抑制內源性過氧化物酶活性。
(2)用Tris鹽酸緩衝液洗2次，每次3min。
(3)以第一抗體血清覆蓋處理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
(4)用Tris-HCl緩衝液洗3次，每次5min。
(5)加SPA-HRP處理30min。
(6)Tris-HCl緩衝液洗3次，每次5min。
(7)DAB-H2O2顯色。
(8)復染、脫水、透明、封固。反應物為棕色。

2.SPA用於PAP法的操作步驟

從動物分離的葡萄球菌掃描電子鏡下的結構

(1)切片脫蠟至水洗。
(2)80%甲醇(含0.6%H2O2)封閉內源酶活性5min。
(3)10%卵白蛋白Tris緩衝液，20min。
(4)第一抗體作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
(5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩衝鹽液洗片5min。
(6)SPA(1μg/ml)5min。
(7)Tris-HCl鹽液洗5min。
(8)PAP複合物(無種屬限制)，5min。
(9)Tris-HCl鹽液洗切片5min。
(10)DAB(0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反應5min，然後水洗。
(11)復染：常用Mayer’s蘇木精液數秒至1min，水洗。
(12)脫水、透明、封固、鏡檢。

3.SPA-HRP的製備 套用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg，SPA5mg。

(1)10mg 溶於新鮮配製的pH8.1、0.3mol/L碳酸氫鈉溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯無水乙醇溶液以封閉酶分子中的氨基，使不發生酶的自身聚合，室溫輕輕攪拌1h。
(2)加入1ml0.04～0.08mol/L的NaIO4，室溫攪拌30min。
(3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫輕攪1h。
(4)對1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩衝液充分透析，換緩衝液3次。
(5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩衝液1ml，室溫輕攪2～3h。
(6)加5mg硼氫化鈉終止氧化，置4℃冰櫃3h或過夜。
(7)對PBS透析24h，4℃離心去沉澱，半飽和硫酸銨洗沉澱結合物3次，溶於1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
(8)對PBS充分透析，經測定後分裝，貯於-20℃冰櫃中保存備用。

用過碘酸鈉法可以得到很高標記率的HRP-SPA標記物，而且保存了抗體的全部活性，敏感度高，穩定性強，大大優於戊二醛標記抗體法，現在也有HRP-SPA的標記物供應，但要注意由於各家所用的SPA可能來源於不同菌株，在性質上可能存在一些差異。

注意事項

葡萄球菌屬

①在使用二硝基氟苯後，會產生氟化氫，應充分透析除淨，否則抑制酶活性。

②標記時過碘酸濃度不宜過高，氧化時間不宜過長，否則會產生過度標記，即多個酶分子結合到一個蛋白A分子上。這些過度標記蛋白A的免疫反應性很差，容易產生非特異性染色。

③標記時加入酶與SPA的比例應適合，比值過大易產生過度標記，比值小則標記蛋白A產率低。

④過碘酸氧化結果能使酶具有多個醛基，從而能與多個蛋白分子的氨基相結合，成為一些大分子的聚合物。因此，有作者強調指出，對要求具有較強的細胞穿透力的免疫細胞化學實驗時應予以考慮是否適用。但有實驗室套用上海生物製品所產生的套用過碘酸氧化法製備的HRP-SPA於免疫電鏡研究仍獲得了較為滿意的結果。

對應藥品

重組金黃色金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)

產品名稱： 重組金黃色金黃色葡萄球菌A蛋白（縮寫為proteinA，SPA，蛋白A）
英文名稱： proteinA，SPA，蛋白A
產品包裝： 5mg/支，10mg/支，20mg/支
產品產地： 國產
純 度：>95%（HPLC檢測）
活 性：>95%人IgG結合活性
成 分： 液 體，含20mm濃度PBS Ph7.4。
分 子 量： 35kD
pH值範圍：pH 2.0-11.0
特異性： 重組蛋白A與人IgG1、IgG2、IgG4，小鼠IgG2a、IgG2b、IgG3有較強結合活性；與人IgG3，小鼠IgG1有較弱結合活性。重組蛋白A還與兔、豬、狗、貓、猴等多種哺乳動物IgG均有較強結合活性。

金黃色金黃色葡萄球菌A蛋白能與人及多種哺乳動物血清IgG分子中的Fc片段結合，結合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；對大白鼠、綿羊的親和力差；對馬、犢牛、山羊等無親和力；對所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類（除少數例外）均不能與之結合。雞的IgG必須與相應的抗原形成複合物才能與SPA結合。SPA與IgG結合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。

SPA除與IgG結合外，還能與血清中少量的IgM和IgA結合，SPA菌對各類免疫球蛋白的吸附率：IgG為90%～98%，IgM為2%～30%，IgA為1.5%～20%。出現共沉反應的SPA與IgG必須有兩個結合部位，它們分別在Fc和Fab段上，缺一雖能與SPA結合，但不出現共沉反應。

該重組金黃色金黃色葡萄球菌A蛋白是大腸桿菌表達的基因工程產品，具有Fc段結合活性高，性能穩定，易於純化等優點。本產品經HPLC純化獲得，純度95%以上，純化過程條件溫和，對蛋白的活性影響小，純化過程不採用抗體柱的親和層析，避免了產品中摻入無關IgG的可能。

重組蛋白A還可與多種報告分子（螢光染料、酶標記、生物素、膠體金、放射性標記等）偶聯並不影響其與抗體結合的活性。這些偶聯反應可用於組織化學、Western雜交、ELISA試驗、膠體金快速試劑等的抗體檢測。另外，重組蛋白A還可固定於微球載體上用於單克隆抗體或多克隆抗體的純化。