苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)是催化直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。此酶的在植物體內次生物質(如木質素等)代謝中起重要作用。

基本信息

簡介

苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶
L-苯丙氨酸解氨酶L-phenylalanin ammo-nialyase
縮寫PAL。是催化直接脫掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。EC.4.3.1.5。是1961年J.Koukol,E.Conn在大麥中發現的。存在於高等植物酵母菌類的可溶性部分。推測分子量為30萬。這是一個可把苯丙氨酸用於酚類化合物合成的酶。在很多情況下,其反應成為酚類化合物合成的有步驟的速率階段。在組織中的活性可隨外界因素而發生顯著變化,用光照,病傷害,植物激素處理等會使活性顯著增加。另外有時還受光敏色素所支配。在多數情況下,在組織中活性增加的同時,酶發生失活作用,這時組織中具有活性酶的量很快就會減少,據認為,這種失活是與類蛋白質物質作用有關。此外也已指出有非活性的酶的存在。

活性測定

原理
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)催化苯丙氨酸的脫氨反應,使NH3釋放出來形成反式肉桂酸。此酶的在植物體內次生物質(如木質素等)代謝中起重要作用。根據其產物,反式肉桂酸在290nm處吸光度的變化可以測定該酶的活性。
材料、儀器設備及試劑
(一)材料:馬鈴薯塊莖
(二)儀器設備:1.紫外分光光度計;2.離心機;3.研缽;4.吸濾瓶;5.紅光裝置;6.打孔器。
(三)試劑:1.0.05mol/L硼酸鹽緩衝溶液(pH8.8);2.0.02mol/L苯丙氨酸(用0.1mol/LpH8.8硼酸緩衝液配製);3.5mmol/L巰基乙醇硼酸緩衝液。
實驗步驟
1.馬鈴薯圓片製備 將馬鈴薯塊莖洗淨、削皮,用打孔器(直徑1.5cm)取圓柱,切除兩頭近表皮處,中間部分切成2mm厚的圓片。先用自來水漂洗,最後用蒸餾水洗一次,用紗布吸乾表面的水。
2.光誘導 將圓片平鋪在濕潤濾紙的培養皿中,置20~30℃紅光下處理24h以誘導PAL(也可接種病原菌誘導等)。
3.酶粗提液的製備 經誘導處理的馬鈴薯圓片5g,加10ml含5mmol/L的巰基乙醇的硼酸緩衝液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或PolyclarAT(除去酚類物質毒害,防止顏色的干擾、少量石英砂在研缽中研磨。勻漿抽氣過濾,濾液10,000rpm離心15min,上清液為酶粗提液。上述操作均在0~4℃下進行。
4.活性測定與計算 1ml酶液加1ml0.02mol/L苯丙氨酸,2ml蒸餾水,總體積為4ml。對照不加底物,多加1ml蒸餾水;反應液置恆溫水浴30℃中保溫,0.5h後用紫外分光光度計在290nm處測定吸光度。以每小時在290nm處吸光度變化0.01所需酶量為一單位(相當每毫升反應混合物形成1μg肉桂酸)。蛋白質含量用Folin-酚法進行測定。

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