質粒拯救

基本概念

質粒拯救(plasmid rescue)是一種確定隨機未知基因的方法。首先將含有調節元件（如35S啟動子）的質粒酶切後插入到植物基因組中。植物隨機的某個基因會被調節，進而使植物出現表型變化。插入質粒的某個酶切位點（如Smal1），在被調節基因中也可能具有相同的酶切位點。這樣，通過一種或多種酶切，就能夠將全部或部分該

基因連著插入質粒一起被切下來。之後，將切下片段自連成環狀，使用調節元件的引物擴增，即可得到目的基因的部分或全部序列。如果得到的只是部分片段，使用5'或3'RACE也可得到全部序列
質粒拯救由Perucho在1980年首創，並用該法克隆雞胸腺苷激酶基因。

主要原理

利用合適的限制性內切酶消化含有T-DNA插入的基因組DNA，直接用連線酶對消化產物連線環化，然後用高效的電擊轉化方法將連線產物轉化大腸桿菌，通過抗性篩選獲得陽性克隆，測序分析即可得到T-DNA的側翼序列。質粒拯救技術的套用和載體有自身條件有很大的關係，首先要選用合適的載體，用於提供拯救質粒在轉化宿主細胞中的複製起點和陽性克隆篩選基因，其次選用合適的核酸內切酶切基因組DNA，環化後得到一個只含有目的片段和抗性篩選基因的微笑質粒即拯救質粒 利用質粒拯救的方法比較直接，不受分離側翼序列的分子量大小的制約，其目的性和準確性都很強，在早期作為一種克隆基因的方法被廣泛用於 果蠅、 真菌、哺乳動物和擬南芥中，比較常用於從突變體中克隆基因。但是，質

粒拯救的最大缺點就是套用範圍受載體制約，套用範圍較窄；在操作過程中與基因組DNA質量、酶消化、連線、大腸桿菌轉化效率等各個環節密切相關，操作繁瑣，費時費力；陽性克隆不能判斷是否為相同的連線產物，往往造成重複測序；假陽性 克隆比例較高，篩選繁瑣，工作量大。因此，質粒拯救法已經不能夠勝任功能基因組學時代的高通量的要求，只能作為其他分離方法無效時的一個補充。