土佐房昌俊原本是大和國興福寺金剛堂的僧人，因為年供問題與大和國針之莊的代官發生了衝突，因而認識了在京都擔任警衛工作的土肥實平。隨後在土肥實平的帶領下來到關東參見了源賴朝，並由此成為了源賴朝的家臣，並且作為源賴朝的御家人參加了承治、壽永之亂。
文治元年（1185年）源賴朝與弟弟源義經產生了對立，10月9日源賴朝在御家人中詢問有誰可以進京刺殺源義經，土佐房昌俊毛遂自薦承擔了這個任務，得知這個訊息的源賴朝大喜過望。土佐房昌俊出發前，源賴朝在下野國中泉莊與土佐房昌俊見了面，見面時土作坊昌俊請求源賴朝照顧自已的老母和幼子，源賴朝一口應承了下來。
土佐房昌俊和弟弟三上彌六家季率領83人從鎌倉出發，10月17日夜對源義經的在京都的住宅六條室町亭發起襲擊。源義經的部下被打了個措手不及，源義經和佐藤忠信一起親自提刀和刺客展開廝殺。不久之後，駐紮在附近得到訊息的源行家部隊趕來支援源義經，土作坊昌俊這才被擊敗退往鞍馬山，途中被源義經的部下趕上並生擒。10月26日土作坊昌俊和其被俘的家人一起在六條河原被斬首。源義經被襲擊的第二天，即10月18日，後白河法皇發布了討伐源賴朝的宣旨，源義經奉旨召集人馬準備與源賴朝開戰。
