乳酸菌製劑檢驗法

基本信息

簡介

【通用名稱】乳酸菌製劑檢驗法
拼音名:
英文名:
書頁號:S1-·62
標準編號:WS1-F03-89

本試驗法包括牛奶凝固力、乳酸鑑別法、活乳酸菌數測定法及其鑑別法。

說明

一、牛奶凝固力及乳酸鑑別法

1.牛奶培養基的製備 取新鮮牛奶,用蒸汽加熱20分鐘或置沸水浴中煮30分鐘後,於冷處放置18小時以上,使乳脂析出,然後用虹吸管吸出脫脂溶液,分裝試管中,每管20ml,用115.5℃蒸汽滅菌20分鐘。

2.試驗法 (1)牛奶凝固力 取供試品0.1~0.3g,加至牛奶培養基20ml中,搖勻,在37℃培養48小時,同時作兩管,作為供試品管,以牛奶培養基為對照管,供試品管的牛奶應呈正常凝固現象(表面無多量乳清分出,凝塊均勻稠密結實,無氣體產生,無消化現象)。
(2)乳酸鑑別 取上述供試品管和對照管的培養液各1ml,分別注入兩支試管 (15×160mm)中,各加10%硫酸3~5滴,振搖,加乙醚約10ml,猛烈振搖,放置數分鐘,分別將上層乙醚液倒入兩支試管(16×180mm)中,於熱水浴中,除去乙醚。殘留物中各加水2ml,搖勻,分別吸取0.2ml置另兩支試管中,各加硫酸2ml,搖勻,置水浴中加熱2分鐘,取出,立刻用冷水冷卻,分別滴入10%愈創木酚的乙醇溶液1滴,振搖後,對照管顯橙色。
供試品管應顯紅色。

3.結果的判斷 (1)乳酸鑑別試驗呈正反應,牛奶呈正常凝固現象,供試品優良。
(2)乳酸鑑別試驗呈正反應,牛奶呈不均勻的粉碎的凝塊,並分出大量乳清,凝塊有氣泡及消化現象,表示有雜菌生長,供試品合格。
(3)乳酸鑑別試驗呈負反應,牛奶呈不正常凝固或者不凝固,供試品不合格。

二、活乳酸菌數測定法

1.培養基的製備 (1)含糖牛肉湯培養基
牛肉浸液 1,000ml
氯化鈉 5g
腖 10g
乳糖 20g
取氯化鈉、腖、乳糖加入牛肉浸液中,置水浴上加溫,攪拌,使完全溶解,放冷至室溫,調節pH值使滅菌後為6.0,115.5℃滅菌20分鐘。
(2)含糖牛肉湯瓊脂培養基 照含糖牛肉湯培養基的處方,加瓊脂使每100ml中含瓊脂1.5~2g,在水浴上加熱使溶解,分裝後,115.5℃滅菌20分鐘。
(3)20%碳酸鈣混懸液 取極細結晶性的碳酸鈣粉末,加水製成20%的混懸液,121.5℃滅菌20分鐘。

2.測定法 (1)供試品稀釋液的製備 按無菌操作法,從兩個包裝供試品中,取樣10g,加入滅菌生理鹽水100ml,振搖均勻,製成混懸液,用1ml的滅菌吸管稀釋製成1:100,1:1,000,1:10,000,1:100,000,1:1,000,000等各種稀釋度的混懸液,每一稀釋度吹洗三次,並更換吸管。
(2)接種與培養 用滅菌吸管吸取每種稀釋度的混懸液1ml,吹入滅菌平皿中,每份同法接種二個平皿。
將20%碳酸鈣混懸液置水浴中加溫後,搖勻,趁熱用滅菌吸管吸取5ml加至已溶化的含糖牛肉湯瓊脂培養基100ml中,搖勻,放冷至45~55℃,取10~15ml加至上述已接種供試品稀釋液的平皿中,隨即轉動平皿,使充分混合均勻,待瓊脂凝固後,翻轉平板,在37℃培養72小時後,觀察結果。有透明圈的菌落即為乳酸菌。
(3)菌落計算 選取菌落分布均勻、菌落數為30~300個的平皿,點數菌落的數目。
求得兩個平皿的平均菌落數(若兩個平皿的菌落數相差一倍以上,需重新試驗),再乘以供試品的稀釋倍數,即為每1g乳酸菌製劑所含活菌數。

三、乳酸菌鑑別法
1.運動性檢查 (1)培養基 用活乳酸菌測定法項下含糖牛肉湯培養基。
(2)鑑別法 自活乳酸菌計數的平皿中,選出具有透明圈的各種不同形態的菌落,每種選取兩個菌落,分別種入含糖牛肉湯培養基中,在37℃培養24小時後,應生長發育良好,取菌液,以懸滴檢查法觀察,應無運動性。

2.石蕊牛奶凝固試驗 (1)石蕊牛奶培養基的製備 取牛奶培養基,每100ml中加入石蕊乙醇溶液2.5ml,混勻,取5~10ml分裝於試管中,管115.5℃滅菌20分鐘。
(2)試驗法 自上項含糖牛肉湯培養液中,取一白金耳菌液,種入5~10ml的石蕊牛奶培養基中,在37℃培養48小時,石蕊應還原為無色,牛奶應呈正常凝固現象,培養基上層表面應呈紫紅色環。

3.顯微鏡檢查 自上項含糖牛肉湯培養液中取菌液塗片,革蘭氏染色後,於油鏡下檢查,記錄其形態和革蘭氏染色的顏色。

4.酸度測定及乳酸鑑別試驗 自上項含糖牛肉湯培養液中取一白金耳菌液,種入牛奶培養基20ml中,另取對照用牛奶培養基20ml,同時在37℃培養48小時後,分別進行酸度測定及乳酸鑑別試驗。

5.接觸酶試驗 自上項含糖牛肉湯培養液中取一白金耳菌液,種於含糖牛肉湯瓊脂斜面上,在37℃培養48小時後,將3%過氧化氫溶液滴加於生長的菌落表面上,觀察有無氣泡產生,有氣泡則為陽性反應,反之則為陰性反應。

新鮮牛奶 取比重在1.028以上的牛奶5ml與水20ml,置50~100ml的錐形瓶中,加酚酞指示液3滴,用氫氧化鈉液(0.1mol/L)滴定至顯示的淡紅色在1分鐘內不完全消失為止。一般新鮮牛奶所消耗的氫氧化鈉液(0.1mol/L)不得超過1.0ml。

乳酸菌的酸度測定 照上法測定。

牛肉浸液 取新鮮牛肉,除去肌腱及脂肪,切細,絞碎後,每1,000g加水3,000ml,充分拌勻,在2~10℃浸泡20~24小時後,煮沸1小時,濾過,壓乾肉渣,補足液量,分裝,121℃滅菌30分鐘,置冷暗處備用。也可用牛肉浸膏3g,加水1,000ml,配成溶液代替。

活乳酸菌計數 如果在較小稀釋度培養基中所生長的菌落數量較多,菌落形態相似,呈極小點狀或梭狀,或在較大稀釋度培養基中菌落形態相似時,可能為乳酸菌生長,照乳酸菌鑑別法項下的懸滴檢查法或石蕊牛奶凝固試驗法鑑別,如為乳酸球菌,應不計算在內。

石蕊乙醇溶液 取石蕊20g,研磨後置錐形瓶中,加入40%乙醇150ml,煮沸1分鐘,倒出上層液,再加入40%乙醇150ml,煮沸1分鐘,倒出上層液,與第一次倒出液合併。
再以40%乙醇加至全量為300ml.滴加鹽酸液(1mol/L),隨加隨振搖,至溶液變紫色為止。pH值應為6.0~8.0。

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