誘導型啟動子

簡介

啟動子分類介紹

組成型啟動子(constitutive promoter)是指在該類啟動子控制下,結構基因的表達大體恆定在一定水平上,在不同組織、部位表達水平沒有明顯差異。目前使用最廣泛的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S 啟動子、來自根癌農桿菌Ti 質粒T-DNA 區域的胭脂鹼合成酶基因Ocs 啟動子,後者雖來自細菌,但具有植物啟動子的特性。
在組成型啟動子調控下,不同組織器官和發育階段的基因表達沒有明顯差異,因而稱之組成型啟動子,雙子葉植 物中最常使用的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子,它具多種順式作用元件。其轉錄起始位點上游-343~-46bp是轉錄增強區 ,-343~-208和-208~-90bp是轉錄激活區,-90~-46bp是進一步增強轉錄活性的區域,在了解CaMV 35S啟動子各種順式作用元件的基礎上,人 們利用它的核心序列構建人工啟動子,以得到轉錄活性更高的啟動子,Mitsuhara等利用CaMv 35s核心啟動子與CaMV 35S啟動子的5'端不同區段 和菸草花葉病毒的5'非轉錄區(omega序列)相連,發現把兩個CaMV 35S啟動子-419~-90(E12)序列與omega序列串聯,在轉基因菸草中GUS有 最大的表達活性,把7個CaMV35S啟動子的-290~-90(E7)序列與omega序列串聯,非常適合驅動外源基因在水稻中的表達。用這兩種結構驅動 gus基因表達,在轉基因菸草和水稻中GUS活性比單用CaMV 35S啟動子高20~70倍。
另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus )中分離的。該啟動子 -222~-173bp負責驅動基因在植物綠色組織和根尖中表達,其中-219/-203是TGACG重複基序,即as1 (activating sequence 1),-183/-180為 GATA(又稱為as2),這兩個元件的互作對控制基因在綠色組織中表達至關重要。該啟動子-178~-63bp包含負責調控基因在維管組織中表達的 元件。CsVMV啟動子在轉基因葡萄中驅動外源基因的轉錄能力與使用兩個串聯的CaMV35S啟動子相當,兩個串聯的CsVMV啟動子轉錄活性更強。 Rance等利用CoYMV(commelina yellow mosaic virus),CsVMV啟動子區和CaMV 35S啟動子的激活序列(as1,as2)人工構建高效融合啟動子,瞬 時表達實驗表明該啟動子可驅動報告基因在雙子葉植物菸草中高效表達,在單子葉植物玉米中其驅動能力比通常使用的γ玉米蛋白啟動子高6倍。因此用這種人工構建的高效 啟動子驅動抗病基因或目的蛋白基因,在雙子葉和單子葉植物中均可達到較理想的效果。
人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子,並初見成效,例如肌動蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子,可以更有效地在單子葉植物中驅動外源基因的轉錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β 亞基基因和植物光敏色素基因中克隆了相應啟動子,用其代替CaMV 35S啟動子,在轉基因菸草中也取得了很好的表達效果。
由於組成型啟動子驅動的基因在植物各組織中均有不同程度表達,套用中逐漸暴露出一些問題。例如外源基因在 整株植物中表達,產生大量異源蛋白質或代謝產物在植物體內積累,打破了植物原有的代謝平衡,有些產物對植物並非必需甚至有毒,因而阻 礙了植物的正常生長,甚至導致死亡。另外,重複使用同一種啟動子驅動兩個或兩個以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制現象。因此, 人們尋找更為有效的組織、器官特異性啟動子代替組成型啟動子,以更好地調控植物基因表達。
②組織特異啟動子(tissue-specific promoter)又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下,基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達,並表現出發育調節的特性。例如菸草的花粉絨氈層細胞中特異表達基因啟動子TA29,豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因啟動子可在轉化植物種子中特異性表達,馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)基因啟動子在塊莖中優勢表達。
2.1根特異啟動子
根的發生和發育是植物發育過程中的重要問題,研究根中特異表達基因及其啟動子無疑是重要的。擬南芥根中特異表達的黑芥子酶(myrosinase)是由Pyk10基因編碼的。Pyk10啟動子中存在若干器官特異性表達和 植物激素應答的特異元件,如ACGT-核心序列、CANNTG-motifs、GATA-motifs、誘導物(elicitor)應答元件W-box((T)TGAC(C))、植物激素應答 元件(如as-1元件、生長素和脫落酸應答元件、Myb元件)和細胞特異表達元件等。其中ACGT,CANNTG,GATA等順式作用元件是決定組織器官特異 表達的轉錄因子結合位點,Myb元件在控制植物次生代謝、調節細胞形態建成及信號傳導通路中起作用。
根特異表達系統可用於研究轉基因植物的高滲脅迫耐受、植物修復和根際分泌等問題。BoriSjuk等用根特異啟動 子mas2',GFP和菸草鈣網蛋白(calreticulin)基因構建融合表達載體,水培轉基因菸草結果表明,根細胞不僅能夠高效生產GFP,而且可將目的 蛋白質分泌到液體培養基中。因此利用該啟動子與其他有用的能編碼蛋白質的基因融合,不僅可大量生產目的蛋白質,且更便於回收產物。
2.2 莖特異啟動子
Trindade等利用cDNA-AFLP技術從馬鈴薯中分離了一個與乙醇脫氫酶非常相似的TDF511(transcript derived fragment),其基因Stgan可能參與植物體內影響赤黴素水平的複合物的合成。在NCBI資料庫中,比較Stgan啟動子與馬鈴薯的patatin Ⅰ和Ⅱ、 蛋白酶抑制子、nodulin 22K和23K等編碼蛋白質基因的啟動子,發現它們包含一些可能與蔗糖應答反應有關的共有序列;該啟動子還包含植物 中幾個保守的轉錄因子(如Dof1,Dof2,Dof3和PBF)的結合位點。構建Stgan啟動子-GUS融合表達載體轉化菸草,GUS組織化學染色顯示該啟動子 驅動基因在莖結節處特異表達,可能參與塊莖形成過程。
研究在莖中特異表達基因的啟動子,不僅可從分子水平了解莖的發生、分化過程,更重要的是利用這些啟動子調 節植物代謝可滿足人類需求,如人們對木質素生物合成及其調控的研究。木質素是植物體內僅次於纖維素的一種含量豐富而重要的有機大分子 物質,它的存在對於增加植物機械強度、遠距離水分運輸和抵抗外界不良環境的侵襲都是非常有益的。然而,木質素的存在也有一定的負面作 用。因此,人們希望通過調節木質素的合成以降低其含量。目前多使用CaMV35S啟動子驅動目的基因,近年來已分離一些木質素生物合成途徑中 關鍵酶基因的啟動子,如4CL,F5H等基因的啟動子,人們正在嘗試利用這些特異性啟動子來調節木質素的生物合成。Bell-Lelong等已從擬南芥 中分離了肉桂酸羥-4-基化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因的啟動子,本實驗室首次從毛白楊中分離了C4H啟動子,並對該啟動子的功 能進行了初步鑑定。GUS組織化學染色和GUS螢光測定結果表明。G4H啟動子驅動外源基因在菸草莖的維管組織中豐富表達,有望將來利用該啟動 子驅動功能基因調控木質素的生物合成過程。
2.3 葉特異啟動子
Marraccini等從咖啡(coffea arabica)中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)小亞基基因RBCS1, 該基因在一年生植物咖啡的葉中特異表達。研究發現RBCS1啟動子上游GTGGTTAAT序列與豌豆RBCS3A啟動子的BoxⅡ核心序列相同;在其啟動子G -box(GCCACGTGGC)兩側分別有一個類I-box(核心序列為GATAAG),形成I-G-I結構,推測G-box十個鹼基的迴文結構可能結合某個轉錄因子;其AT-1 box(AGAATTTTTATT) 與其他RBCS和CAB基因的AT-1 box(AATATTTTTATT)相比只有兩個鹼基不同;類L-box(AAAATTAACCAA)與馬鈴薯RBCS1和RBCS3A啟動子的相同。由此 可見,植物葉特異表達順式元件具高度保守性。
有趣的是Taniguchi等在玉米中發現了一個雙元啟動子系統(dual promoter system)。PPDK(pyruvate, orthophosphate dikinase)是C4植物光合反應中的一個葉綠體酶,該酶基因Pdk具有一個雙元啟動子系統(C4Pdk啟動子和細胞質Pdk啟動子)。這 兩個啟動子的區別在於起始密碼子和拼接方式的差異,C4Pdk啟動子驅動Pdk轉錄成較長的mRNA。基因產物定位在葉綠體中;細胞質Pdk啟動子在 Pdk基因的第一個內含子中,驅動Pdk轉錄成較短的mRNA,它所編碼的蛋白質定位於細胞質中,又稱為細胞質Pdk啟動子。C4Pdk啟動子是受光誘 導的強啟動子,驅動基因在玉米葉肉細胞中特異表達;而細胞質Pdk啟動子是個弱啟動子,且不具有組織特異性。大多數C4植物的光合作用相關 基因的表達具有細胞特異性,且主要在轉錄水平調節基因表達活性,因此,可利用該啟動子在C4植物葉肉細胞中高效表達外源基因。
2.4 花特異啟動子
高等植物發育過程中花器官的形成是一個十分複雜的過程,它包括一系列器官分化及嚴格控制的細胞及生化變化 ,同時伴隨大量基因的協同表達。目前人們最為關注的是花葯中特異表達的基因,抑制或破壞這些基因的表達可導致雄性不育,即可利用基因 工程的方法創造雄性不育系。
人們克隆了許多花葯特異表達的基因,如在花葯絨氈層特異表達的TA29,A9、在花粉壁特異表達的Bp4A等,但這 些基因都是在花葯營養細胞中表達,與生殖細胞的分化無關。Singh等從百合(Lilium longiflorum)中克隆了一個LGC1基因的啟動子,該啟動子 驅動的基因只在雄配子細胞中表達。LGC1啟動子-242~-183 bp之間可能包含某種順式作用元件,它的缺失會導致細胞特異性表達特性喪失,由 此可知LGC1在生殖細胞中的表達特異性可能是由於其他細胞中存在某些轉錄因子抑制該基因表達的結果。這是迄今為止發現的第一個有關雄配 子細胞特異性的啟動子,在研究花葯發生和受精作用中將會是一個有用的工具。
2.5 果實、種子特異性啟動子
利用果實或種子等器官特異性啟動子調控基因表達,不僅可提高基因在這些部位的表達量,將生物能耗降到最低 ,利於表達產物的分離,而且可有目的地提高轉基因植物果實或種子的營養或改善其品質。
番茄E8啟動子是成熟果實中乙烯應答性基因的啟動子,其-409~-263bp可控制E8基因在果實成熟過程中特異表達 ,-2181~-1088bp為乙烯應答激活域。Sandhu等利用E8啟動子驅動呼吸道合胞病毒F抗原基因成功轉化番茄植株,用果實特異表達抗原餵飼小鼠,可誘導小鼠產生特異 的黏膜免疫反應、血清學抗體反應及TH1型細胞免疫反應。基因表達調控與免疫學的有效結合,使得轉基因植物口服疫苗可在不久的將來問世。 2A12是番茄中另一種果實特異性啟動子,毛自朝等利用該啟動子驅動ipt調節果實內源激素的含量,不僅可獲得無籽果實,還能改善果實的品質 。
種子特異性啟動子中研究較多的是胚乳特異性谷蛋白基因啟動子。谷蛋白占水稻種子儲藏蛋白總量的70%~80% ,早在1986年Takaiwa等就克隆了第一個水稻穀蛋白基因的cDNA。該基因轉錄起始位點-261~-1 bp之間有若干控制種子特異性表達的順式作用元件,如AACA-box、種子凝集 素-box、未成熟種子核因子結合位點等。此外,啟動子更上游處還有若干增強子和調節元件,如-300bp處的RY重複序列,它是核蛋白的結合位 點。Yoshihara等研究發現水稻穀蛋白啟動子上游-104~-60bp之間有兩個順式作用元件AACA和GCN4,GCN4能增強啟動子的活性,而啟動子的組織特異性則須兩者協同作用。
雖然植物食物中包含人類營養所需的絕大多數礦物質和有機養分,但日常攝入的食物往往不足以提供人體所需的 營養。因此人們希望通過植物基因工程提高植物中所含的營養物質。水稻穀粒中含有鐵蛋白,但多積累在糊粉層,在穀粒加工過程中會失去很 多鐵。Vasconcelos等用水稻胚乳特異性谷蛋白基因啟動子驅動大豆鐵蛋白基因,使轉基因水稻穀粒中鐵和鋅的含量都有所增加,而且鐵蛋白主 要積累在胚乳中,不會在食品加工過程中丟失。無獨有偶,Datta等利用水稻穀蛋白特異啟動子驅動八氫番茄紅素合酶基因PSY,在水稻胚乳中 成功合成維他命原A。
以植物為生物反應器生產生物可降解塑膠是本實驗室研究目標之一。葉梁等使用大豆7S種子特異性啟動子,構建 二價和三價種子特異性表達載體轉化油菜。這樣將產物聚-3-羥基丁酸酯(PHB)定位與種子質體中,不僅增加了底物供應,也減少PHB對植物生長 發育的影響。為最佳化已有表達框架,減小基因沉默發生幾率,Zhang等從油菜H165基因組DNA中分離到napinB啟動子的部分序列——nap300。序 列分析表明,napinB啟動子包含一些在進化上保守性很高的序列,如AT-rich sequenc,TACACAT保守序列、RY重複序列、G-box等,這些順式作 用元件可能對種子特異性表達起重要的調控作用。將nap300與GUS基因融合轉化菸草,GUS在胚和胚乳中均有表達;GUS螢光檢測顯示nap300啟動 子具有驅動基因在種子發育晚期表達的能力。
③誘導型啟動子(inducible promoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下,該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。目前已經分離了光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。
3.1天然誘導型啟動子
長期進化過程中,植物通過啟動不同基因的表達可在一定範圍內適應光、溫、水等環境的變化。這些基因的啟動 子通常包含比較保守的順式作用元件,利用這些保守元件可以推測新基因的可能功能,也可用這些環境應答基因的啟動子與抗逆基因融合,從 而使轉基因植物更好地適應逆境。
天然誘導型啟動子包括光、溫度、激素應答啟動子等。光應答啟動子中通常存在GT-1-motif,I-box,G-box和 AT-rich sequence等順式作用元件;溫度應答啟動子中多存在HSE-motif,CCAAT-box,CCGAC-motif等;激素應答啟動子中則包含各種激素應答 元件。G-box作為蛋白結合的一個高度保守的位點,是植物中通用的受信號誘導的順式作用元件,在植物和動物中具高度保守的核心序列CACGT 。G-box通常與另外一個順式作用元件如I-box,H-box等協同作用,在細胞接受外界信號時調節轉錄起始的頻率。這種機制可能是通過G-box及 其結合蛋白相互作用產生一個內部環境,其他調節蛋白與啟動子區域有效結合,使細胞準確而有選擇地起始轉錄。
有些誘導型啟動子同時具有組織特異性,如RBCS1啟動子,既包含葉特異表達元件,又帶有幾個光應答元件 (LREs),受光的誘導調節。當轉基因菸草由光照轉入黑暗時,該啟動子驅動的GUS活性比在光下低許多,Northern雜交幾乎檢測不到GUS的表達。
由於植物生長環境及基因表達的複雜性,從外界環境的刺激到啟動應答基因的表達之間的信號通路往往是相互交 叉的,這樣啟動子中包含的順式作用元件通常也不止一種,如從葡萄中克隆的白藜蘆醇合酶基因Vst1啟動子,當病蟲侵害、UV照射、臭氧環境 或化學物質誘導時均可啟動Vst1的表達。Riou等發現該啟動子上分別帶有乙烯和臭氧的應答元件,可適應不同的外界刺激。擬南芥rd29A基因在 乾旱、高鹽鹼、低溫或脫落酸誘導時表達。其啟動子-174~-55區域包含乾旱應答因子(DRE,TACCGACAT)和ABA應答因子(ABRE,ACGTGG/TC),且 該基因在ABA誘導表達時,DRE和ABRE是相互獨立的。
當植物受病蟲害侵犯時,受傷部位會立刻啟動細胞程式性死亡,即發生所謂超敏反應(hypersensitive response 。HR)。HR通常會啟動未受傷部位產生次級防禦反應,從而對一般的病蟲害產生普遍抗性,這種現象稱為系統獲得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)。菸草中SAR基因是一個至少包含十二個成員的家族,SAR也受一些諸如水楊酸(SA),INA(dichloroisonicotinic acid)和 BTH(benzothiadiazole)等化學物誘導。菸草Sat8.2b基因啟動子-205/-201是as-1元件(TGACG),-146/-141和-276/-271為兩個GT-1結合序列 (GGAAAT),-97/-94、-322/-318和-761/-758分別是Dof結合基序(AAAG),前兩者被認為可以與SA應答的轉錄因子結合而起關鍵作用。啟動子缺 失實驗表明Sar8.2b啟動子-927~-728和-351~-197bp分別包含有SAR高效誘導基因表達所需的順式作用元件,缺少了這兩個DNA片段。轉基因煙 草GUS表達活性明顯降低。
3.2 人工構建的誘導型啟動子
在開發植物天然存在的誘導型啟動子的基礎上。人工構建可誘導表達系統以滿足不同需求。目前研究最多、最深 入的可誘導表達系統是化學誘導表達系統。自第一次用化學誘導表達系統TetR,通過CaMV35S啟動子成功調節cat基因的表達以來已有20多年的 歷史,現已發展成日臻完善的植物表達外源基因的可誘導表達系統。該系統包括兩個轉錄單元:一是與化學誘導物結合的轉錄因子的表達,另 一個轉錄單元包含一個應答元件,經誘導物處理後,通過它激活轉錄因子,從而激活或抑制目的基因的表達。
一個理想的化學誘導表達系統應具備以下特點:首先,外源基因在植物體自身不表達或低水平表達,當添加誘導 物後,高效誘導基因表達;其次,誘導物需要有較強的專一性;第三,誘導物可快速啟動基因表達的“開”與“關”;而且誘導物對植物無毒 或低毒。根據控制基因表達的方式,可將化學誘導系統分為兩大類:阻遏型啟動子系統和激活型啟動子系統。
3.2.1 阻遏型啟動子系統
該系統建立在阻遏蛋白與轉錄因子在空間構型相互作用的基礎之上。當誘導物不存在時,激活蛋白與阻遏蛋白結 合,基因正常轉錄;添加誘導物後,誘導物與激活蛋白結合或阻止其與阻遏蛋白結合,阻遏蛋白則與啟動子上的某些順式作用元件結合,抑制 基因轉錄,如以四環素抑制子為基礎的四環素抑制系統(tTA)。Love等用包含四環素抑制子的啟動子Topl0與報告基因GFP相連轉化擬南芥,發現 用100 ng/mL的四環素即可抑制GFP的表達,而且改變培養基中四環素的濃度,可調節GFP的表達水平。
3.2.2 激活型啟動子系統
在抑制型啟動子系統中,抑制基因轉錄所需誘導物的量往往超出植物適應的範圍,而且在真核生物中激活基因比 抑制基因轉錄更容易,近年發展了一些激活型啟動子系統,如地塞米松誘導的GR系統、雌二醇誘導的ER系統、殺蟲劑誘導的ECR系統等。激活型 啟動子系統的優點是只有當誘導物存在時才能啟動基因表達,去除誘導物後,基因表達很快被關閉,這樣就可以人為地精確、快速控制基因的表 達。
Bohner等研究了一種可雙向調控外源基因表達的系統,他們將改造的啟動子Top10與報告基因GUS相連,使用轉錄 激活子TGV作為基因開關。轉基因菸草結果表明,用地塞米松處理3小時後基因表達量達到高峰;用四環素處理6小時即可關閉基因表達。該誘導 系統最大的優點在於可迅速調節基因的表達與否,當外源基因可能對植物產生不良影響時這一點顯得尤為重要。
為了滿足套用需要,人們開始研究便於在大田使用的誘導表達系統,殺蟲劑誘導的EcR系統就是一個很好的範例 。Unger等利用歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的蛻皮激素配基結合結構域(EcR LBD)、玉米C1激活域(AD)和GAL4 DNA結合結構域(DBD)構建化 學誘導激活子,把它與玉米ms45最小啟動子相連,構建成可受殺蟲劑誘導的人工啟動子誘導系統。他們利用該系統在玉米雄性不育突變株ms45 中成功地誘導了育性恢復基因MS45的表達

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