血清學反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見的沉澱、凝集現象。在食品微生物檢驗中，常用血清學反應來鑑定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。
血清學反應的一般特點
1)抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時，會出現交叉反應。
2)抗原體的結合是分子表面的結合，這種結合雖相當穩定，但是可逆的。
3)抗原體的結合是按一定比例進行的，只有比例適當時，才能出現可見反應。
4)血清學反應大體分為兩個階段進行，但其間無嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段，反應速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢，但不出現肉眼可見現象。第二階段為抗原體反應的可見階段，表現為凝集、沉澱、補體結合反應等。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。而且，在第二階段反應中，電解質、PH、溫度等環境因素的變化，都直接影響血清學反應的結果。
習慣上將經典的血清學反應分三種類別：凝集反應、沉澱反應和補體結合反應。
１、凝集反應
顆粒性抗原（細菌、紅細胞等）與相應抗體結合，在電解質參與下所形成的肉眼可見的凝集現象，稱為凝集反應（Agglutinationreaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應中，因為單位體積抗體量大，做定量實驗時，應稀釋抗體。
１）直接凝集反應
顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的反應，稱為直接凝集反應(Directagglutionreaction)。
a.玻片凝集法。是一種常規的定性試驗方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用於鑑定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數分種後若出現肉眼可見的凝集塊，即陽性反應，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便，但不能進行定量測定。
b.試管凝集法。是一種定量試驗方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應抗體及其含量。常用於協助診斷某些傳染病及進行流行病學調查。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。因為要測定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然後加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時觀察，血清最高稀釋度仍有明顯凝集現象的，為該抗血清的凝集效價。
２）間接凝集反應
將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關的，顆粒狀微球表面，然後與相應抗體（抗原）作用，在有電解質存在的條件下，即可發生凝集，稱為間接凝集反應(Indirect
agglutination)。由於載體增大了可溶性抗原的反應面積。當載體上有少量抗原與抗體結合。就出現肉眼可見的反應，敏感性很高。
２、沉澱反應
可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電解質存在下，經過一定時間，形成肉眼可見的沉澱物，稱為沉澱反應（Precipitation）。反應中的抗原稱為沉澱原，抗體為沉澱素。由於在單位體積內抗原量大，為了不使抗原過剩，故應稀釋抗原，並以抗原的稀釋度作為沉澱反應的效價。
１）環狀沉澱反應：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特製小試管中，然後沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應，則在兩液界面出現白色的沉澱圓環。
２）絮狀沉澱反應：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內混勻，如抗原抗體對應，而又二者比例適當時，會出現肉眼可見的絮狀沉澱，此為陽性反應。
３）瓊脂擴散試驗：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內擴散，若抗原抗體對應，且二者比例合適，在其擴散的某一部分就會出現白色的沉澱線。每對抗原抗體可形成一條沉澱線。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉澱線。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類型。單向擴散是一種定量試驗。可用於免疫蛋白含量的測定。而雙向擴散多用於定性試驗。由於方法簡便易行，常用於測定分析和鑑定複雜的抗原成分。
３、補體結合反應
補體結合反應(Complementfixation
reaction)是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。補體無特異性，能與任何一組抗原抗體複合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的複合物結合，就會出現溶血現象，如果與細菌及相應抗體複合物結合，就會出現溶菌現象。因此，整個試驗需要有補體、待檢系統（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統（綿羊細胞和溶血素）五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結合。如果出現溶菌，是補體與待檢系統結合的結果，說明抗原抗體是相對應的，如果出現溶血，說明抗原抗體不相對應。此反應操作複雜，敏感性高，特異性強，能測出少量抗原和抗體，所以套用範圍較廣。
血清學方法--血凝和血凝抑制試驗
一些病毒或病毒的血凝素能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細胞發生凝集，這種凝集紅細胞的現象稱為血凝(Hemagglutination，HA)。正粘病毒和副粘病毒是最主要的紅細胞凝集性病毒；其他病毒包括披膜病毒、細小病毒、某些腸道病毒和腺病毒等也有凝集紅細胞的作用，但常要求比較嚴格的反應條件，例如一定的pH範圍等。各種病毒的血凝素性質不盡相同。某些病毒可在很廣的pH條件下呈現血凝作用，某些病毒則只在很窄的pH範圍內才能凝集紅細胞。某些病毒的血凝作用具有溫度依賴性，也就是只在一定溫度範圍內才出現血凝現象；但另一些病毒卻可在4℃、室溫和37℃呈現同樣的血凝作用。病毒凝集的紅細胞種類，也隨病毒種類而不同，例如某些病毒主要對人和禽的紅細胞呈現凝集作用，另一些病毒則可凝集豚鼠或大鼠等的紅細胞。
當病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以封閉病毒顆粒或其血凝素時，則紅細胞表面的受體就不能與病毒顆粒或其血凝素直接接觸，這時紅細胞的凝集現象就被抑制，稱為紅細胞凝集抑制(HemagglutinationInhibition，HI)，也稱為血凝抑制反應。血凝的原理因病毒而有所不同，如痘病毒對雞紅細胞發生凝集作用並非是病毒的本身，而是痘病毒的產物類脂蛋白的作用。而流感病毒的血凝作用是病毒囊膜上的血凝素與紅細胞表面的受體糖蛋白相互吸附而發生的。病毒的血凝現象大致可以分為可逆轉型、不可逆轉性、凝集條件嚴格型三類。
血凝和血凝抑制試驗有常量法和微量法兩種，目前國內外廣泛使用的都是微量法，各要素用量均為25ul，微量法省時、省料、高效。以下簡要介紹本次試驗的主要內容，詳細內容參見各國標。
各實驗室所採用的HA和HI試驗程式不同，下面的例子是套用V型微量板進行的試驗，兩種方法反應總體積都為75ul，本試驗所用試劑為如下：
1．生理鹽水：用蒸餾水或去離子水配製成0.85％NaCl溶液，高
壓滅菌備用。
2．紅細胞懸液：采雞血液，加於倍量的紅細胞保存液-阿氏液中，置4℃普通冰櫃保存，可用一個月。使用前，取紅細胞懸液1份，用5～10倍量的生理鹽水洗滌3次，直至上清無色透明。取沉澱紅細胞，加生理鹽水製備成1％紅細胞懸液。
3．病毒液：包括接種病料後收穫的雞胚羊水、尿囊液或感染小鼠的肺乳劑，經3000轉離心沉澱15分鐘，除去較大顆粒後套用。血凝抑制試驗用的血凝素抗原，系用病毒接種雞胚後收穫的雞胚尿囊液和羊水，以3000轉離心20分鐘，吸取上清液，加入3倍量的滅菌生理鹽水，並加入1：10000硫柳汞防腐，保存於4℃冰櫃備用。
4．特異性抗血清：用作陽性對照。一般用雞製備。取血凝效價在1：320倍以上的雞胚尿囊液，注射壯齡雞的腹腔內，每次10毫升，共3次，每次間隔1周。最後一次注射後2周放血，分離血清，置-20℃以下凍存。血凝抑制效價可達1：640倍以上。另一法是將尿囊液靜脈或腹腔注射壯齡公雞，每次2毫升，間隔1周，如上法注射4～5次，血凝抑制效價有時可高達1：5000倍以上。按上法給壯齡公雞靜脈或腹腔注射1次尿囊液，7天后採血，也可獲得血凝抑制效價有時可達1：160倍的抗血清。
5．8單位或4單位抗原的配製：以能引起紅細胞100％凝集的病毒最高稀釋度作為終點，即1個HA單位，終點滴度除以8即為含8HA單位的抗原。例如，如果血凝終點滴度為1：256，則8個血凝單位的稀釋度應是1:32（256除以8），此例中將1ml抗原加入31ml生理鹽水即為8HA單位抗原。取8HA單位的抗原加入等量生理鹽水即為4HA單位抗原。
血凝素效價測定：將待檢病毒液用生理鹽水作1：5稀釋，在大孔塑膠滴定板或小試管中進行倍比稀釋，直至1：2560，每孔(管)0.25毫升，最後1孔只加生理鹽水作為對照。隨即向各孔內加入0.25毫升的1％雞紅細胞懸液，充分混勻，於室溫放置45分鐘後判定結果。紅細胞凝集程度以＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋和－表示。最後1孔(管)的紅細胞應無凝集現象。
紅細胞呈細砂粒狀均勻鋪於孔底者為＋＋＋＋，即100％凝集；紅細胞均勻鋪於孔底，但邊緣不整而稍向孔底集中者為＋＋＋，即75％凝集；紅細胞於孔底形成一個環狀，四周有小凝集塊者為＋＋，即50％凝集；紅細胞於孔底形成圓團，但邊緣不夠光滑，四周稍有凝集塊者為＋，即25％凝集；紅細胞於孔底形成圓團，邊緣光滑整齊者為-，即無凝集。
血凝素效價以＋＋為終點，即以能夠使50％紅細胞凝集的血凝素的最高稀釋度作為該血凝素的血凝效價。
血凝(HA)試驗：在微量血凝板的1～12孔均加入25ul生理鹽水。用微量移液器吸取25ul抗原加入第1孔，混勻。從第1孔吸取25ul抗原液加入第2孔，混勻後吸取25ul加入第3孔，如此進行倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取25ul棄之，第12孔作為生理鹽水對照。每孔再加入25ul生理鹽水。之後每孔均加入25ul1％雞紅細胞懸液，在微量振盪器上振盪1min，使其混合均勻；在室溫(20℃～25℃)下作用40min後觀察結果。紅細胞凝集呈薄膜狀，均勻地覆蓋孔底，強凝集時凝集塊皺縮呈團狀或邊緣呈鋸齒狀，即100％的紅細胞凝集；紅細胞凝集呈薄層，但是面積較小，孔底中央有紅細胞沉積呈小圓點狀，即50％的紅細胞凝集；紅細胞全部沉於孔底中心呈小圓點狀，周圍光滑，無分散的紅細胞，即無凝集現象。能使紅細胞100％凝集的病毒最高稀釋度作為該病毒的血凝價。
血凝抑制(HI)試驗：在微量反應板的第1～11孔各加入25ul生理鹽水，第12孔加入50ul生理鹽水。吸取25ul血清加入第1孔內，充分混勻後吸25ul於第2孔，依次對倍釋至第10孔，從第10孔吸取25ul棄去。1孔～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液25ul，室溫(約20℃)靜置至少30min。每孔加入25ul1％的雞紅細胞懸液混勻，輕輕混勻，靜置約40min(室溫約20℃)，若環境溫度太高可置4℃條件下進行，對照紅細胞將呈顯鈕扣狀沉於孔底。以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。只有陰性對照孔血清滴度不大於2㏒2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。HI價小於或等於3㏒2判定HI試驗陰性；HI價等於4㏒2為可疑，需重複試驗；HI價大於或等於5㏒2為陽性。
血清學方法--瓊脂擴散試驗
瓊脂擴散試驗，又稱免疫擴散反應或凝膠沉澱反應，基本原理是可溶性抗原和相應抗體在含有電解質的瓊脂凝膠中擴散相遇，特異性地結合形成肉眼可見的線狀沉澱物的一種免疫血清學技術。
瓊脂凝膠的含水量極大，常用瓊脂凝膠(1％～1.2％)含水98％以上，可使分子量20萬以下的大分子物質自由通過。由於大多數抗原和抗體的分子量都在20萬以下，所以能在瓊脂凝膠中自由擴散。當抗原和抗體相應且比例適當，兩者相遇就會出現一條沉澱線。一對抗原和抗體，形成一條沉澱線，故可套用瓊脂擴散試驗鑑定抗原和抗體成分、抗體的純度、抗原或抗體的相對效價等。
接觸和擴散於其中者，稱為單相擴散，也稱輻射擴散或環狀沉澱試驗；使抗原和抗體雙方同時在瓊脂凝膠中擴散而相遇成線者，稱為雙向擴散。由於瓊脂擴散試驗的操作簡便，不需要特殊設備，且有較好的特異性和檢出率，故已成為一種廣泛套用的免疫學技術。在動物病毒學中廣泛用於檢測病毒抗原和毒型鑑定。應當指出，由於家禽免疫球蛋白的特殊性，瓊脂凝膠中的NaCl含量應為8％，而不是通常的0.85％，使用這樣的濃度可取得更好的結果。
1.操作方法
(1)抗原及抗體分別加入相應孔中，每孔加入50ul。
(2)加好的板放入濕盒中加蓋後置37℃溫箱中24小時觀察結果。
2.判定
(1)強陽性(＋＋＋)：在被檢血清孔與抗原孔之間有明顯的沉澱線，並與標準陽性血清的沉澱線末端互相連線者。
(2)陽性(＋＋)：在被檢血清孔與抗原孔之間有較弱的沉澱線，並與標準陽性血清的沉澱線末端互相連線者。
(3)弱陽性(＋)：標準陽性血清孔與抗原孔之間的沉澱線末端向被檢血清孔內側彎曲者。
(4)疑似(±)：標準陽性血清孔與抗原孔之間出現的沉澱線末端向被檢血清孔內側偏彎或微彎者。
(5)陰性(－)：被檢血清孔與抗原孔之間不形成沉澱線，或者標準陽性血清的沉澱線向相鄰的被檢血清孔直伸或向外側偏彎者，判定為陰性。被檢血清孔與抗原孔間出現的沉澱線與標準陽性血清的沉澱線呈現交叉現象時，為非特異反應，判為陰性。
3．注意事項
(1)瓊脂質量影響試驗結果，一般套用精製瓊脂粉或瓊脂糖配製瓊脂凝膠板。
(2)孔徑大、孔距小，較易出現沉澱線，但孔距太小，不易鑑別兩條以上的沉澱線，故在病毒抗原分析時，孔距不宜太小。
(3)一般認為37℃感作比較容易出沉澱線，但對易於失效的病毒抗原，可置室溫或4℃感作。
(4)抗原、抗體的濃度越高，出現沉澱線的時間越快，故必要時，可將抗原、抗體先作適當的濃縮處理。
4．染色
為提高沉澱線的可見度，或需長期保存標本時，可按下述方法處理標本並染色。
(1)漂洗：將瓊脂板用綢布包裹後，浸泡於生理鹽水中12小時，其間換液2～3次，再以蒸餾水浸泡5～6小時，其間換液2次，藉以除去未結合的蛋白質。
(2)固定：解開綢布，將瓊脂板浸入70％酒精配製的2％醋酸溶液中固定1小時。
(3)染色：首先配製醋酸-甲醇液，即取10ml冰醋酸、20ml水和70ml甲醇混合。再取氨基黑10B0.1g溶於100ml醋酸-甲醇液中，即為氨基黑染色液。
將固定好的瓊脂擴散板浸泡於氨基黑染色液中10分鐘，再用醋酸-甲醇液洗去底色，乾燥後即可長期保存。
血清學方法--酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
1.分類和操作原理
酶聯免疫吸附試驗或稱酶聯免疫吸附測定法(Enzyme—Linkedimmunosorbentassay，ELISA)。是當前套用最廣泛的一種測定方法，它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固相載體上，隨後的一系列免疫學和生物化學反應都在此固相載體上進行，免疫酶測定試驗包括間接法、雙抗體夾心法和競爭法以及近年來發展的一些改良法。
(1)間接法：將已知抗原吸附(或稱包被)於固相載體，孵育後洗去未吸附的抗原，隨後加入含有特異性抗體的被檢血清，感作後洗除未起反應的物質，加入酶標抗體同種球蛋白(如被檢血清是兔血清，就需用抗兔球蛋白)，感作後再經洗滌，加入酶底物，底物被分解，出現顏色變化，顏色變化的速度及程度，與樣品中的抗體量有關，即樣品含有抗體愈多，顏色出現得也愈快、愈深。
(2)雙抗體夾心法：是檢測抗原的方法，將特異性免疫球蛋白吸附於固相載體表面，然後加入含有抗原的溶液，使抗原和抗體在固相表面上形成複合物。洗除多餘的抗原，再加入酶標記的特異性抗體，感作後漂洗，加入酶底物，顏色的改變與待測樣品中的抗原量成正比。
(3)競爭法：利用酶標記抗原和未標記抗原共同競爭有限量抗體的原理，測定樣品中的抗原。操作時需要有隻加酶標記抗原的系統作為對照。將抗體吸附於固相載體表面，感作後漂洗，加入待檢抗原樣品和酶標記抗原(也可先加待檢樣品，稍後再加酶標記抗原)。對照則只加酶標記抗原。感作後漂洗加入酶底物溶液。含酶標記抗原的對照系統出現顏色反應。而在待檢系統中，由於樣品中未標記抗原的競爭作用，相應抑制顏色反應。待檢抗原含量高時，其對抗體的競爭能力強，所形成的不帶酶的抗原抗體複合物量亦多，帶酶複合物的形成量相對減少，從而使酶催化底物時產生有色產物的量也減少，而帶酶複合物量卻相對增多，酶催化底物時產生有色產物的量也增多。因此，待檢系統中顏色變化的程度與其中抗原的含量成負相關。
此外，免疫酶染色法中抗酶染色法的免疫球蛋白橋法和PAP法等也都可以用於酶聯免疫吸附測定，除以上這些基本方法之外，科學工作者又在此基礎上，通過“技術雜交”設計出了許多改良方法，舉例如下：
阻斷ELISA：將已知抗原包被於固相載體，孵育後洗去未吸附的抗原，隨後加入被檢血清，感作後洗去未起反應的物質，加入抗已知抗原的酶標抗體。感作後再洗滌，加入酶底物，底物顏色變化的速度與程度，與被檢血清中的抗體量有關，樣品中含有的抗體愈多，與固相載體上抗原結合得愈多，剩下給已知抗體結合的位點愈少，顏色出現的愈慢、愈淺。
夾心間接ELISA：本法主要套用酶標記抗抗體測定抗原。先將特異性抗體(如兔IgG)吸附於固相載體表面，孵育後沖洗，隨後加入待檢抗原樣品，感作後沖洗。再加入不同種動物(如豚鼠)的相同的特異性抗體。感作沖洗後，加入酶標記抗第二種抗體的動物球蛋白(如兔抗豚鼠免疫球蛋白)。再行感作沖洗後，加入酶的底物。其所產生的顏色變化與第二步中加入的抗原量成正相關。由於預先吸附在固相載體表面的抗體能夠特異性地捕捉標本中的抗原，所以，這種方法又稱為抗原捕捉ELISA(AC—ELISA)。
抗體捕捉ELISA：主要套用於IgM的檢測。它可以解決由於IgM在液體中含量較低，用常規間接法測定常不能獲得滿意效果的問題。抗體捕獲ELISA的操作原理是：首先用抗u鏈抗體(最好是單抗)包被載體，隨後加入待檢體液(血清或腦脊髓液等)，感作後沖洗，再加入酶標抗原或抗原～酶標抗體複合物，再行感作沖洗後，加入酶的底物。反應產生的顏色變化與體液中的特異性IgM含量成正比。
一步法ELISA：本法是雙抗體夾心法的拓展，其基礎是分別使用針對不同抗原決定簇的單克隆抗體包被載體和進行酶標記。具體方法是用針對待檢抗原不同抗原決定簇的一種或幾種單克隆抗體包被載體，包被完畢的載體經適當處理可長期保存或作商品供應。檢測時，同時加入被檢標本和酶標記的針對待檢抗原的另一種或幾種抗原決定簇的單克隆抗體，感作後沖洗，再加入酶作用的底物，反應所產生的顏色變化與待檢抗原的含量成正比。本法由於待檢抗原和酶標抗體同時一步加入，故稱一步法，其優點是操作十分快捷，一般可在1小時內得出結果，某些商品化的一步法ELISA系統，整個檢測只需幾分鐘。
2.ELISA的操作要領
(1)固相載體的選擇：目前廣泛套用的固相載體是聚苯乙烯微量反應板，有的供應商還把聚苯乙烯製成條或小杯，可隨意組合套用。另一種廣泛套用的固相載體是PVC塑膠軟板。這些材料的吸附效果與塑膠的類型、表面性質有關，生產加工工藝的不同以及其他選擇性能好的固相載體。吸附性能可用以下方法測定：在固相載體的每一個小孔中，加入同一份同一稀釋度的抗原或抗體，使之吸附於小孔表面，然後按常規方法操作，加底物顯色後測定每一孔中溶液的A值。一般認為，每兩空的A值誤差均在±10％內，否則不可使用。
固相載體用標準陰、陽性抗體或抗原孔的光密度差值要大，二者相差10倍以上屬合格。
近年來，還有一些研究人員套用硝酸纖維素膜作為ELISA的載體，直接在膜上點樣，進行一系列的操作，結果表明這種載體使用方便，敏感性、特異性等並不亞於用塑膠作載體的ELISA試驗，由此衍生出了斑點—ELISA(Dot—ELISA)。還有人用疏水聚酯布作為ELISA載體，使ELISA結果更易保存，由此衍生出了布—ELISA(C—ELISA)。
(2)預備試驗：在正式進行ELISA試驗前，必須進行預試驗以確定酶結合物，包被抗原或抗體的最適濃度、底物的最適反應時間等。
酶結合物的確定：以pH9.6的碳酸鹽緩衝液將IgG稀釋至100ug／ml，加入固相載體的每一孔中進行包被，洗滌後將酶結合物以1：200、1：400、1：800、……作系列稀釋，依次加入各孔，每一稀釋度加2孔。反應完畢後加底物顯色，讀取結果，以能產生光吸收值(A)為1.0的稀釋度為結合物的最適濃度。
包被蛋白質濃度的確定：酶結合物濃度確定後，應測定包被蛋白質(抗體或抗原)的最適濃度。其步驟是：將欲被包被的蛋白質用pH9.6的碳酸鹽緩衝液作1：10、1：20、1：40……系列稀釋，以每一稀釋度包被固相載體的2個孔，然後進行常規的ELISA操作。最後讀取結果，同樣以能產生光吸收值(A)為1.0的稀釋度為包被蛋白質的最適濃度。
底物最適作用時間的確定：以最適稀釋度抗原和酶結合物進行試驗，加入底物後在不同時間終止反應，即可確定最適反應時間。
(3)包被：將蛋白質(抗原或抗體)吸附於固相載體表面的過程稱為包被。除應注意選擇合適的載體(見前述)外，還應注意：
包被液的pH：通常用pH9.5～9.6，0.05mol／L或0.1mol／L的碳酸鹽緩衝液稀釋抗原或抗體，吸附時的pH一般為9.0左右。如pH較低，則吸附時間延長，但pH低於6.0則非特異性吸附增加。
吸附時間與溫度：一般為4℃過夜，有時也可採用37℃吸附1～5小時。
蛋白質液：在固相載體上，每孔加入量一般為0.1～100ug／ml。若濃度太高，會因抗原或抗體蛋白分子之間的相互作用較大而影響載體對蛋白質的吸附；如濃度太低，則敏感性下降。
對於細胞培養產生的病毒抗原，或其他高濃度抗原，也可試用下述方法進行包被，將細胞培養物或其他抗原液加入反應板的各孔後，每孔滴入1滴20％～25％的甲醛溶液，室溫固定15分鐘，其間不斷溫和地晃動。最後用洗滌液或蒸餾水洗滌除去甲醛，包被即告完成，該法簡便省時，包被效果確實。
(4)洗滌：在ELISA試驗過程中，與免疫酶染色法一樣，為了除去前一步所加的未結合的抗原、抗體或結合物，防止其與隨後加入的相應物質或底物產生不應有的反應，則每一步都必須進行洗滌(清洗)。其方法是，先將載體各孔甩乾，再加洗滌液充滿各孔，靜置3～5分鐘，如此重複三次。然後將載體甩乾，立即加入下一步的試劑。
目前較多使用的洗滌液是含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的PBS。套用含有0.05％吐溫-20，0.01mol／LpH7.4的Tris—HCl效果也很好。
(5)封閉：抗原或抗體包被後，載體表面仍可能遺留有未吸附蛋白質的空白位點，從而造成下一步的非特異性吸附，即使用較高濃度的蛋白質包被，也有必要對包被後的載體進行處理，以封閉可能存在的空白位點。常用的封閉液有：1％～3％牛血清白蛋白、3％～5％脫脂乳、10％牛或馬血清等。加入封閉液後，可在37℃吸附2小時，然後洗滌。
(6)結果判定：ELISA結果的判定方法很多，常用的有以下幾種：
目視比色法：在ELISA試驗完成後，直接以肉眼觀察反應產物的顏色變化，作出陰性或陽性的判斷。這種方法主要用於ELISA的定性實驗中。
光電比色法：用分光光度計在適宜的波長下測定反應後的光密度值，然後以下列方法之一對樣品進行定性或定量：
a．絕對值法：在小心控制的條件下，結果以絕對值來表示。在抗體測定中，先確定未感染群體的絕對值平均值(X)，然後在此水平上選擇一個指示感染值(一般是X±2SD或X±3SD)，如果被檢血清的值在該值之上，為陽性；在其下，為陰性。
b．P／N比法：即被檢樣品(P)的光吸收值(A)和陰性標準樣品(N)平均(A)值之比，以大於某一比值(一般為≥2)為陽性。
c．終點法：所有血清通過連續稀釋滴定，並測定每一稀釋度的A值，根據陰性血清的測定結果，選定一個絕對值(見絕對值法)，以產生這個絕對值的稀釋倍數作為“效價”。
d．單稀釋法：被檢樣品不作連續稀釋，而根據預試驗的結果選擇一個合適的稀釋度。所有樣品都按該稀釋度稀釋，反應後測定光吸收值，將此值與用標準樣品作成的標準曲線比較，或用回歸方程計算，得出被檢樣品的“效價”。有人將這種方法稱為單稀釋ELISA。
套用實例
(1)套用間接ELISA檢測牛白血病抗體(定性)：以持續感染牛白血病病毒的胎羊腎細胞培養物作為製備病毒抗原的材料。收穫細胞培養液320ml，於4℃以2000g離心沉澱15分鐘，取上清液。隨後再於4℃以80000g離心沉澱2小時。將沉澱病毒重新懸浮於內含0.15mol／L、pH7.2的0.01mol／L磷酸鹽緩衝液內，並以PBS稀釋至6ml。層加於5ml20％蔗糖(W／W)PBS柱上，以110000g於4℃離心沉澱2小時，將沉澱病毒重新懸浮於3.2mlPBS，總共濃縮100倍。經鑑定合格後，分裝小瓶，-70℃保存備用。
以包被液將抗原稀釋50倍，隨後滴加於微量滴定板的孔內，每孔200ul。4℃感作過夜。用洗滌液泡洗5次，隨後加入以0.01mol／L、pH7.4的PBS(內含0.5mol／L氯化鈉和0.05％吐溫-20)作1：5稀釋的被檢血清，每份血清加3個孔，每孔200ul，37℃感作3小時，如上泡洗4次，再加1：1000稀釋的酶標記兔抗牛IgG200ul，37℃感作1小時，如上泡洗4次，最後加5-氨基水楊酸底物溶液，每孔200ul。室溫感作15分鐘後，加入50ul1％NaN3終止反應後進行判定。另設陽性血清和陰性血清對照。以P／N≥1.5作為陽性判定標準。
(2)套用夾心ELISA測定糞便標本中的牛病毒性腹瀉～黏膜病病毒(BVDV)：王新平等套用牛病毒性腹瀉～黏膜病病毒高免血清提取IgG，以pH9.6的碳酸鹽緩衝液稀釋至1mg／ml，滴加於聚苯乙烯的滴定板的孔內，每孔100ul，於4℃包被過夜，並用5％兔血清的PBS(pH7.4，內含0.05％吐溫-20)37℃封閉1小時，然後用洗滌液(pH7.4PBS，內含0.05％吐溫-20)泡洗3次，每次3分鐘，甩乾後加入1：10稀釋的待檢糞樣，每孔100ul，37℃感作2小時，再以上述洗滌液泡洗3次，隨後加入1：400稀釋的抗BVDV酶標抗體100ul，37℃感作2小時，如上泡洗3次以。最後加鄰苯二胺，(OPD)—H2O2底物溶液100ul，室溫感作30分鐘，再加50ul2mol／L硫酸終止反應。目測或以分光光度計測定492nm波長的A492值，進行判定。以P／N≥2為陽性。按常規，設定陰、陽性對照，如上述。
(3)單稀釋ELISA檢測雞傳染性喉氣管炎抗體：毛春生等以雞胚皮膚細胞培養的雞傳染性喉氣管炎病毒為抗原包被聚苯乙烯反應板，然後加入1：80稀釋的待檢血清，感作洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG，再感作洗滌後，加OPD—H2O2底物，在37℃條件下反應30分，以2mol／L硫酸終止反應，讀取光吸收值。實驗結果表明，血清單稀釋度(1：80)的光吸收值(A值)與終點法所測定的ELISA滴度(ET)的自然對數間呈良好的線性關係：1n(ET)＝5.80A＋3.96(r=0.94＞r0.01)，單稀釋法比終點法可提高實驗效率8～10倍。
(4)單克隆抗體ELISA抑制法檢測細胞培養物中的豬瘟兔化弱毒：房德興等首先將豬瘟兔化弱毒抗原包被40孔酶聯反應板，再加入不同稀釋度豬瘟兔化弱毒細胞培養物與等量1：1000稀釋的酶標抗豬瘟單克隆抗體混合物，37℃作用45分鐘後洗滌，最後加入OPD—H2O2底物溶液。用硫酸終止反應後測定A值，按以下公式計算抑制率，並以Reed—Muench法計算50％抑制價。抑制價＝空白孔A—待檢孔A值×100％空白孔A值
(5)斑點—ELISA(Dot—ELISA)檢測狂犬病病毒：李金中等為檢測狂犬病病毒，建立了夾心間接Dot—ELISA，其操作步驟為：①用鉛筆在硝酸纖維素膜(NC)的光滑面分成0.5cm×0.5cm的小格；②用碳酸鹽緩衝液將倉鼠抗狂犬病病毒IgG抗體稀釋至50ug／ml，每格點樣2ul，室溫晾乾；③以0.01mol／LPBS、1％吐溫-20、5％小牛血清(pH7.4)的封閉液在37℃下作用30分鐘，洗滌(每次泡洗3分鐘，共3次，下同)晾乾備用。④用小濾紙片分別蘸取陰性、陽性和待檢抗原置每一小格內，37℃感作30分鐘，洗滌。⑤將兔抗狂犬病病毒IgG(第一抗)用封閉液稀釋至25ug／ml，倒入含有反應膜的平皿中，37℃感作30分鐘，洗滌；⑥用封閉液將驢抗兔酶標抗體(第二抗)稀釋1000倍，倒入含有反應膜的平皿中，37℃感作30分鐘，洗滌；⑦用pH7.6的Tris—HCl緩衝液將DAB稀釋至0.5mg／ml，室溫顯色10分鐘後，判定結果。與背景顏色一致判為陰性，具有肉眼可見的棕色斑點判為陽性。實驗結果表明，夾心間接Dot—ELISA、夾心間接ELISA和小鼠腦內間接種三種方法可以相互替代，其中以夾心間接Dot—ELISA最為簡便。
