氮藍四唑

又名為氯化硝基四氮唑藍。英文名：nitro-blue tetrazolium 即NBT.常和BCIP配成混合液，為鹼性磷酸酶底物之一，在鹼性磷酸酶的催化下生成不溶性的藍色產物。常用於免疫組化(IHC)、SOD活性測定、免疫細胞化學(ICC)和蛋白印跡(WB)等實驗。 　　分子式為：C40H30N10O6C12 　　分子量為：817.6 　　CAS為：[298-83-9]

原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在於動、植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基的酶。本實驗依據超氧物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生O2，可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，後者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除O2，從而抑制了甲腙的形成。於是光還原反應後，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據此可以計算出酶活性大小。
材料、儀器設備及試劑（一）材料；水稻或小麥葉片
（二）儀器設備：1.高速台式離心機；2.分光光度計；3.微量進樣器；4.螢光燈（反應試管處照度為4000Lx）；5.試管或指形管數支。
（三）試劑 1. 0.05mol/L 磷酸緩衝液（pH7.8）；2. 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩衝液定容至100ml；3.750μmol/L氮藍四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩衝液定容至100ml，避光保存；4. 100μmol/LEDTA－Na2溶液：稱取0.03721gEDTA－Na2用磷酸緩衝液定容至1000ml；5. 20μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用蒸餾水定容至1000ml避光保存。

實驗步驟

1. 酶液提取 取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g於預冷的研缽中，1ml預冷的磷酸緩衝液在冰浴上研磨成漿，加緩衝液使終體積為5ml。取1.5～2ml於1000rpm下離心20min，上清液即為SOD粗提液。
2. 顯色反應取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測定管，另2支為對照管，按下列加入各溶液：試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時）0.05mol/L磷酸緩衝液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黃素0.320μmol/L酶液0.052支對照管以緩衝液代替酶液蒸餾水0.25總體積3.0混勻後將1支對照管置暗處，其它各管於4000Lx日光下反應20min（要求各管受光情況一致，溫度高時間縮短，低時延長）。
3. SOD活性測定與計算 至反應結束後，以不照光的對照管做空白，分別測定其它各管的吸光度。

結果計算

已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50％為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)
上式中，SOD比活力＝SOD總活性蛋白質含量式中SOD總活性以每克鮮重酶單位表示；比活力單位以酶單位／mg蛋白表示Ack照光對照管的吸光度AE樣品管的吸光度V樣品液總體積（ml）Vt測定時樣品用量（ml）W樣鮮重（g）蛋白質含量單位為：mg蛋白／g鮮重。