四氮唑比色法

四氮唑比色法

皮質激素類的C17位的α-醇酮基具有還原性。在強鹼性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲臢(formazan),後者在可見光區有最大吸收。

基本信息

原理

該反應在一定條件下可定量完成,且生成的有色甲臢具有一定的穩定性,可用於甾體激素類藥物的含量測定。

種類

最常用的四氯陛鹽有兩種:

(1)2,3,5-三苯基氮化四氮唑(2,3,5-triphenyltetramlium chloride,縮寫為TTC),簡稱為氯化三苯四氮唑或紅四氮唑(red tetramline,RT),其還原產物為不溶於水的深紅色三苯甲簪,在480~490nm波長處有最大吸收。氯化三苯四氮唑顯色靈敏度較低,但空白吸收較小。

(2)藍四氯陛(blue tetramline,BT),即3,3’-二甲氧苯基-雙4,4’-(3,5-二苯基)氮化四氮唑{3,3’-dianisole-bis[4,4’-(3,5-diphenyl)tetramlium chloride]},其還原產物為暗藍色的雙甲簪,在252nm波長處有最大吸收。

套用示例

以中國藥典收載的醋酸氫化可的鬆軟膏的含量測定為例,測定方法如下:

1.對照品溶液的製備

精密稱取醋酸氫化可的松對照品25mg,置100ml量瓶中,加無水乙醇適量使溶解,並稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.供試品溶液的製備

精密稱取本品2.5g(相當於醋酸氫化可的松25mg),置燒杯中,加無水乙醇約30ml,置水浴加熱使溶解,再置冰水中冷卻,濾過,濾液置100ml量瓶中,如此提取3次,濾液併入量瓶中,加無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,即得。

3.測定‍

精密量取對照品溶液與供試品溶液各1ml,分別置乾燥具塞試管中,各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液(取氯化三苯四氮唑lg,加無水乙醇使溶解成200ml)lml,搖勻,再各精密加氫氧化四甲基銨試液(取10%氫氧化四甲基銨溶液lml,加無水乙醇使成10ml)1ml,搖勻,在25℃的暗處放置40~45分鐘,照分光光度法,在485nm的波長處分別測定吸收度,計算即得。

討論

四氮唑比色法四氮唑比色法
本法廣泛用於皮質激素類的測定,但當藥物被分解破壞(C17-α-醇酮基被氧化)後即無此反應。所以分解產物對本法無干擾,但在測定過程中受到各種因素的影響,如反應溫度和時間、水分、PH值、氧和光線等。

1.溫度與時間的影響

呈色速度一般隨溫度增高而加快,但在室溫或30℃恆溫條件下顯色易得重現性較好的結果,反應時間視供試品和試劑的種類不同而異。中國藥典多數在25℃暗處反應40~45分鐘。

2.取代基的影響

反應原理是C21-羥基被四氮唑氧化,當C21-羥基酯化後,其反應速度較C21-羥基游離時的反應速度慢;酯化的醯基結構越複雜則反應速度越慢。

3.空氣及光線的影響

反應及其產物對光及氧敏感,因此必須用避光容器並置於暗處顯色,同時在達到最大呈色時間後,立即測定吸收度。TTC法形成的產物對空氣中氧敏感.顯著影響顏色的強度和穩定性,因此英國藥典規定在加入試劑後要往容器中充氮氣。

4.溶劑和水分的影響

多數採用95%的乙醇,但有時為了減少整個反應液中水分的含最則採用無水乙醇。含水量過大會使呈色速度減慢,含水量不超過5%時.對結果幾乎無影響。醇中的醛類雜質必須除去,因為少量乙醛會使吸收度增高,故一般使用無醛醇作為溶劑。

5.鹼的種類和濃度

目前最常用的是氫氧化四甲基銨,能得到滿意結果。一般用甲醇或乙醇將10%的氫氧化四甲基銨溶液稀釋後再用,反應完畢後溶液中鹼的濃度通常約為0.01mol/L。

6.干擾物的影響

有些還原性物質如抗壞血酸、還原糖、硫醇、多元酚等都能與四氮唑鹽反應而引起干擾,但在甾體激素原料和製劑的分析中不易遇到。某些賦形劑如聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂對BT法有較顯著的干擾,山梨醇和角鯊烯也有干擾,因此,測定油膏、冷霜等製劑時必須先分離才能測定。

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