shRNA真核表達載體構建

shRNA真核表達載體構建

構建的shRNA真核表達載體或者mirshRNA真核表達載體,由於載體上均帶有LR同源重組臂,所以這些載體均可作為YRBIO腺病毒包裝系統中的穿梭載體使用。如果目的細胞質粒轉染效率較低,則可直接以這些載體為基礎包裝腺病毒,利用腺病毒感染目的細胞。

介紹

YRBIO-shRNA表達系統

作為RNA干擾實驗的第一步,靶位點的選擇,以及相應的shRNA表達載體構建,是整個RNA干擾實驗的重中之重。靶位點選擇恰當,shRNA干擾效率高,整個RNA干擾實驗就能夠事半功倍,否則,就會做許多無用功。

shRNA表達載體構建後均可作為YRBIO腺病毒包裝系統中的穿梭載體使用。如果目的細胞質粒轉染效率較低,則可直接以這些載體為基礎包裝腺病毒,利用腺病毒感染目的細胞。

有許多免費軟體或網站能夠提供靶位點選擇及shRNA序列設計,但是這種免費軟體算法落後,設計出的shRNA序列有效率只有25%~30%左右。與之相對應的,是一些商業化軟體,或者現成的商業化shRNA庫,由於其算法先進,設計原則合理,其提供的shRNA序列的有效率通常能達到75%以上,亦即可以達到每四條shRNA有三條有效。

shRNA真核表達載體構建 shRNA真核表達載體構建

基於以上,YRBIO系統在國內率先引進代表RNA干擾領域全球頂尖水準的TRC(The RNAi,RNA干擾協會)開發的TRC shRNA庫。該庫針對人、小鼠、大鼠等數萬個基因,每個基因提供3~5條shRNA(已構建至載體上),總數達五萬多條,且數量還在不斷增加。經過大規模實驗驗證,其中超過75%均為有效shRNA,其干擾效率均大於70%(大多數超過80%)。

以此shRNA庫為基礎,針對每個基因,可提供3~5條高質量的shRNA序列,並且構建到shRNA真核表達載體上。由於此資料庫中的shRNA序列有效性超過75%,亦即理論上來說,每一套shRNA克隆中,必定至少有一條shRNA的干擾效率超過70%。右圖為攜帶綠色螢光的shRNA真核表達載體pYr-1.1-hU6-EGFP質粒圖譜 (attL1和attL2為腺病毒重組位點)。

只需事先了解需要干擾的目的基因,我們就會為您從資料庫中調取相應的shRNA序列信息,然後,您可以選擇合適的shRNA表達系統來表達shRNA,進行RNA干擾實驗。

選擇需要干擾的目的基因,從資料庫中調取相應的shRNA序列信息,然後,選擇合適的shRNA表達系統來表達shRNA。

YRBIO系統提供的shRNA真核表達載體,共有hU6、mU6、hH1、h7SK等四種polIII型啟動子可供選擇,可選擇攜帶螢光(包括綠色螢光、紅色螢光)或不攜帶螢光。除此之外,還提供mirshRNA真核表達載體,可以進行mirshRNA真核表達載體構建。

利用腺病毒的高感染效率、高表達效率,更好地進行RNA干擾研究實驗!

既可以用來當普通的shRNA真核表達載體用,同時又是穿梭載體,可以拿來包裝腺病毒,而且其干擾有效性、干擾效率大部分都超過 80%!

shRNA真核表達載體構建 shRNA真核表達載體構建

選用YRBIO-shRNA表達系統,具有如下優點

(1)shRNA序列數據依然來自國外成熟shRNA資料庫,質量有保證。RNA干擾效率的高低主要取決於靶位點的選擇、shRNA序列的設計,而由於YRBIO所採用的shRNA序列來自國外成熟shRNA資料庫,算法先進,靶位點成功率高,所以shRNA的干擾成功率非常高。

(2)您可以選擇構建一條或者多條,靈活度高。

(3)多種啟動子,有螢光或無螢光,綠色螢光或紅色螢光等可自由選擇,以更好地配合後續實驗。

(4)載體可作為普通shRNA表達載體使用,亦可作為腺病毒包裝系統的穿梭載體使用,以進行腺病毒包裝。

右圖為不攜帶螢光的shRNA真核表達載體pYr-2.1-hU6質粒圖譜(attL1和attL2為腺病毒重組位點)。

表達系統匹配

此shRNA資料庫亦有一套原裝進口的shRNA表達系統相匹配,針對每個基因的一套shRNA序列均已構建至相應的shRNA表達載體上,可直接使用,整套產品均為原裝進口。

此系統中,裝載shRNA序列的真核表達載體,同時也是YRBIO第三代慢病毒包裝系統中的穿梭載體。也就是說,如果目的細胞質粒轉染效率較低,那么只需相應的慢病毒包裝系統中的包裝質粒、轉染試劑、293T包裝細胞,便可以將這些shRNA包裝慢病毒,利用慢病毒的高感染效率、高表達效率、長期表達特性,更好地進行RNA干擾研究實驗!

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右圖為shRNA真核表達載體pYrbio-LT-1質粒圖譜

選用原裝進口shRNA表達系統,具有:

優點:

(1)原裝進口產品,未做任何改動。

(2)裝載shRNA序列的真核表達載體,同時也是慢病毒包裝系統中的穿梭載體,可用以包裝慢病毒。

缺點:

(1)載體上沒有螢光標記。

(2)載體骨架稍微有點大,有7K左右。

TRC

TRC(The RNAi,RNA干擾聯盟)是由麻省理工學院和Harvard牽頭建立的合作機構,包括Massachusetts General Hospital、Harvard Med school、Dana Farber Cancer Inst、The Broad Institute、Whitehead Institute、MIT、Academica Sinica (Taiwan)和另外5個國際性組織,代表著RNA干擾領域的全球最頂尖水平。該組織計畫在3年內構建數量達15,000個人類基因和15,000個小鼠基因的shRNA文庫。第1版的TRC shRNA文庫包括35,000 shRNA克隆(其中人類基因有5300個,小鼠基因有2200個),其它新構建的克隆每個季度會陸續公布。

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