SRB檢測方法的原理
1.SRB檢測方法的原理
磺醯羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。SRB是一種粉紅色陰離子染料，易溶於水，在酸性條件下可特異性地與細胞內組成蛋白質的鹼性胺基酸結合；在540 nm波長下產生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關，故可用作細胞數的定量檢測。SRB染色後不會像MTT法那樣很容易變色，細胞固定染色後在96孔板中可以放置較長時間，因而受測定時間的影響較小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可穩定較長時間。因此不同時間點固定的96孔細胞培養板可在同一時間測定，測定的吸光值結果不會受到明顯影響。吸光值與SRB濃度作圖時，在OD單位1.5—2.0以下為線性，當超出線形範圍時，最好稀釋後重新讀數。雖然SRB法比其他檢測方法操作步驟繁瑣，但是由於時間可以自己掌握，不受限制，因此適用於高通量篩選。
SRB檢測的操作步驟
2.SRB檢測的操作步驟
1)細胞固定：藥物作用時間終點時，每孔加入50μL4℃預冷的TCA溶液(30%，w/v)固定細胞，TCA溶液的終濃度為10%。靜置5 min移入4℃冰櫃中固定1 h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾乾。
2)染色：待96孔板室溫下晾乾後，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配製)70μL，染色30 min後倒掉染液，用1%(v/v)乙酸沖洗4次，去除未結合的染料，室溫晾乾。
3)檢測：用100μL非緩衝Tris-base鹼液(10mM，pH=10.5)溶解與細胞蛋白結合的染料，水平搖床上振盪20min，採用酶標儀540nm處測定光吸收值。操作中，應注意洗除染料時操作需迅速，避免用移液器吸取液體，防止動作過慢造成與細胞蛋白結合的染料解吸附。
SRB檢測的計算公式
3.SRB檢測的計算公式
根據美國國立癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)關於SRB檢測的介紹，細胞增殖百分率的計算存在以下兩種情況：
1)Tx-T0>0，
PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)
2)Tx-T0<0，
PG=100×(Tx-T0)/T0
其中，
T0：藥物作用前的細胞經過固定、染色後測得平均吸光值；
C：培養基中加有等體積的DMSO，沒有藥物作用的陰性對照的平均吸光值（陰性對照）；
Tx：藥物作用終點時細胞經過固定、染色後測得平均吸光值。
PG即Percentage Growth，是指藥物作用的樣品孔與陰性對照孔中細胞增殖量的百分率。
