簡介
DGGE(
denaturing gradient gel electrophoresis)，即變性梯度凝膠電泳，是根據
DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發生變化，從而將片段大小相同而鹼基組成不同的DNA片段分開。具體而言，就是將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的
聚丙烯醯胺凝膠中電泳，隨著電泳的進行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當它到達其變性要求的最低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態，這就導致其遷移速率變慢，由於這種變性具有序列特異性，因此
DGGE能將同樣大小的DNA片段很理想地分開，它是一種很有用
分子標記方法。現已廣泛套用於生物多樣性調查、親緣關係鑑定、
基因突變檢測等多個領域。
DNA螺鏇
DGGEDGGE的特點
DGGE/TGGE已廣泛用於分析自然環境中細菌、藍細菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性。這一技術能夠提供群落中優勢種類信息並同時分析多個樣品，具有可重複和操作簡單等特點, 適合於調查種群的時空變化, 並且可通過對條帶的序列分析或與特異性探針雜交分析鑑定群落組成。DGGE和TGGE分別通過逐漸增加的化學變性劑線性濃度梯度和線性溫度梯度可以把長度相同但只有一個鹼基不同的DNA片段分離。DNA分子的雙鏈在特定溫度下會分離，這個溫度取決於互補鏈的氫鍵含量（富含GC的區域融解溫度較高）和相鄰鹼基的引力。
DGGE系統主要步驟
DGGEDGGE對微生態的分析一般包括三個步驟：核酸提取，16SrRNA
序列的PCR擴增以及DGGE指紋圖譜分析。有些學者通過克隆、測序建立微生物區系的16SrRNA/DNA文庫，通過系統發育分析，建立進化樹，從而獲得微生物多樣性信息，但這種方法相對於指紋圖譜技術來說，費時費力，價格也相對昂貴。
核酸提取
DGGE微生物總DNA的提取是整個分子生物學技術的基礎,是否能獲得具有代表性的總DNA樣品將決定後續分析的可行性。一般認為微生物提取總DNA的方法分為細胞裂解和核酸抽提兩個步驟。細胞
裂解有三種:機械法、化學法和酶法。機械法包括玻璃珠法、超音波法、凍融法等;化學法包括加入SDS、苯酚等;酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K 和溶解酶等。而許多研究者用其中兩種或三種方法進行組合,發現組合後提取總DNA 的效果較好。Stahl等(1988)在含有SDS和酚的體系中加入適量的玻璃微珠
,機械法裂解瘤胃樣品中的菌體細胞。Zhu等用酶法和玻璃珠相結合的方法提取雞盲腸內容物的微生物總DNA。核酸抽提一般用酚- 氯仿-異戊醇抽提,這種方法對去除雜蛋白有良好的效果。Reichardt等(1994)認為, CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)法也是常用的方法。不需要貴重儀器,操作較為簡單,能廣泛適用於各種植物的核酸提取,純度也能滿足許多分子生物學操作的要求,所以使用日趨廣泛。
16SrRNA基因序列的PCR擴增
DGGE細菌的核糖體RNA按沉降係數分為5S、16S和23S三種,16SrRNA基因是細菌染色體上編碼該rRNA的相應DNA系列。16SrRNA基因序列全長1540bp ,有保守區和可變區之分,每種細菌的保守區都是相同的,能反映生物種類的親緣關係,為系統發育重建提供線索;可變區因細菌種類而異,通過保守區設計引物,擴增出可變區,就可以得知微生物多樣性信息。大多數情況下,可根據16SrRNA基因V3區和V6-V8區設計細菌特異性引物進行PCR擴增,有時為了更加準確得獲得微生物多樣性的信息,可先通過細菌16SrRNA序列全長通用引物進行PCR擴增,再對V3或V6-V8區進行擴增。Yu等的研究表明,通常使用16S的V3區進行PCR擴增後進行DGGE分析,如果所測的序列長度比較長時,也可以使用16S的V3-V5或V6-V8區。
DGGE指紋圖譜分析
DGGE電泳圖譜的分析最常用的是相似性聚類分析法。DGGE 膠通過掃瞄器輸入計算機,通過Molecular Analysis軟體進行相似性分析。通過DGGE後得到的指紋圖譜,每一個條帶代表某個微生物優勢菌群,通過測序和序列比對,可以得出此優勢菌群的種類。
技術套用
一旦待測DNA片段的解鏈得到確定，電泳膠可作為分析多種樣品的標準。通常用 單一膠板多個PCR擴增的片段；我們主張首先分別檢查每一個片段的少數樣品，如果 在膠上出現的帶彼此間無干擾，那么在加樣以前就可先混勻樣品。PCR擴增後對變性 梯度膠的實驗結果的解釋一般是簡單明了的。如果檢測的DNA有突變或多態性存在， 那么就可觀觀察到遷移速率的改變，比野生型DNA或慢或快。靶序列為異源雙螺鏇。 在PCR最後幾個循環中擴增DNA濃度增高到一定的水平，即使在高濃度的競爭性寡核苷 酸引物存在的條件下，也能有效地使兩條互補的DNA退火．形成異源雙螺鏇。由於這 些異源雙螺鏇分子不穩定，因此在DGGE上異源雙螺鏇分子的遷移速率比同源雙螺鏇分 子不穩定，因此在DGGE上異源雙螺鏇分子的遷移速率比同源雙螺鏇分子慢。正如上面 讀者論過的，DGGE的這種特徵是有益的，因為異源雙鏈DNA使凝膠電泳的分辯率增 加。par當觀察到DGGE中出現有變化的帶型時，根據研究者的需要可採取幾種不同的 方法。
在大多數情況下，GC髮夾法可用來檢測一個基因以發現與疾病直接相關的突 變。以前未能檢測的突變體，可以直接通過PCR擴增產物的DNA序列分析確定。雖然有 可能確定雜合子個體的PCR擴增樣品DNA分子中帶兩個等位基因的DNA序列，但是由於 兩個不同核苷酸序列在一組孔道中的位置交叉使測序膠的情況很複雜。減少該問題的 方法是從變性梯度膠中純化突變的等位基因，經PCR重新擴增，並對其直接測序。實 際上，用從這些膠中純化出的DNA片段已笪出了很好的結果。如果研究僅僅是為了了 解遺傳連鎖，通過對家族中有關的個體進行研究實驗，從變性梯度膠上可得到有關的 資料，而不需知道序列。同樣地，如果系統被用來檢測大量個體是否具有一個或一組 已知突變，從變性梯度膠中直接得到的數據足可以得出結論，特別是在含已知突變的 正對照克隆或DNA基因樣品作為標記時。
總之，我們建議用PCR．GC髮夾和DGGE綜合法檢測長度在500BP以下的DNA片段上 所有可能發生的鹼基變化。我們發現用幾組寡核苷酸檢測長達2500BP的完整基因組 DNA區實際上是可行的，然而需作出更大的努力來檢測更長的DNA片段。該方法在檢測 基因編碼區域的突變中尤其有用。編碼靶基因的信使MRNA可合成第一條鏈CDNA，基因 的各片段可用合適的引物進行PCR擴增，以笪到完整的基因。當一個大片段的DNA需進 行多態性檢測，而又沒有必要檢測該區域可能發生的每個鹼基變化時，我們建議使用 另外兩種方法。其中方法之一是用PCR擴增長約2－5KB的DNA片段，用限制性內切酶切 片段，而後進行DGGE分析；方法之二是用具高頻切割的限制性內切酶酶解基因組DNA， 經DGGE，隨後電轉移到尼龍膜上，用放射同位素標記的探針檢測。
