蛋白酶k

蛋白酶k

蛋白酶K是一種從白色念 珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶,具有很高 的比活性,是DNA提取的關鍵試劑。該酶 在較廣的pH範圍(4〜12.5)內及高溫 (50〜70°C)均有活性,用於質粒或基因組 DNA、RNA的分離。在DNA提取中,主 要作用是酶解與核酸結合的組蛋白,使 DNA游離在溶液中,隨後用不同方法進行 抽提,除去雜質,收集DNA。EDTA等螯 合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。蛋 白酶K貯存液一般為10mg/ml或20mg/ml。 貯存於一20°C。蛋白酶K溶液為無色透明, 如出現沉澱就不能再使用。(陸惠玲)

簡介

從林伯氏白色念球菌(tritirachium album limber)中純化得到。據資料顯示:該酶有兩個Ca2+結合位點,它們離酶的活性中心有一定距離,與催化機理並無直接關係。然而,如果從該酶中除去Ca2+,由於出現遠程的結構變化,催化活性將喪失80%左右,但其剩餘活性通常已足以降解在一般情況下污染酸製品的蛋白質。所以,蛋白酶k消化過程中通常加入EDTA(以抑制依賴於Mg2+的核酸酶的作用)。但是,如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白,如角蛋白一類,則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩衝液。在消化完畢後、純化核酸前要加入EGTA(ph8.0)至終濃度為2mmol/l,以鰲合Ca2+。

蛋白酶K,是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族胺基酸和芳香族胺基酸的羧基端肽鍵。此酶經純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由於蛋白酶K在尿素和SDS中穩定,還具有降解天然蛋白質的能力,因而它套用很廣泛,包括製備脈衝電泳的染色體DNA,蛋白質印跡以及去除DNA和RNA製備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH範圍內(pH 4-12.5)均有活性。

推薦反應緩衝液:50mMTris-HCl(pH7.5),10mM CaCl2 。

蛋白酶K配製標準:20mg/ml蛋白酶K配製標準(proteinase K):將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,輕輕搖動,直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然後分裝成小份貯存於-20℃。

抑制劑

蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶,因此可以用苯甲基磺醯氟抑制其作用,苯甲基磺醯氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑。

作用

值得注意的是,蛋白酶K在原位雜交技術中通常用於雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用,以增加探針與靶核酸結合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細胞的結構有一定的破壞,導致組織切片的脫落,細胞核的消失,從而影響雜交結果.EDTA緩衝液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現的問題,並能達到理想的染色效果.

保存方法

保存:保存在-20℃冰櫃里,避免反覆凍融,有效保證12月。

孵育溫度為55至65℃,理想孵育溫度為58℃,孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時。

套用

蛋白酶K已廣泛套用在皮革、毛皮、絲綢、醫藥、食品、釀造等方面。皮革工業的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶,既節省時間,又改善勞動衛生條件。蛋白酶還可用於蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清。臨床上可作藥用,如用胃蛋白酶治療消化不良,用酸性蛋白酶治療支氣管炎,用彈性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對外科化膿性創口的淨化及胸腔間漿膜粘連的治療。加酶洗衣粉是洗滌劑中的新產品,含鹼性蛋白酶,能去除衣物上的血漬和蛋白污物,但使用時注意不要接觸皮膚,以免損傷皮膚表面的蛋白質,引起皮疹、濕疹等過敏現象。

相關詞條

相關搜尋

熱門詞條

聯絡我們