胺基酸順序分析法

測量蛋白質中胺基酸順序的方法，主要根據英國F.Sanger實驗中的方法發展而來，該法首先套用於胰島素的胺基酸順序測定並於1953年獲得成功。近年來生化工作者發展了用測定核酸的順序推測蛋白質順序的方法，由於DNA測序技術已相當成熟，因此對於用傳統的蛋白質化學方法難以測定的大分子或生物體內含量很低的蛋白質，此方法將是十分有效的。

一般步驟是：①測定蛋白質分子中多肽鏈的數目，根據蛋白質末端殘基的摩爾數和蛋白質的分子量可以確定一個分子中肽鏈的數目。②拆分蛋白質分子的多肽鏈，如蛋白質分子由幾條不同的多肽鏈構成，則需將多肽鏈拆開並單獨分離出來，然後測定每條多肽鏈的胺基酸順序。對於寡聚蛋白質可用變性劑，如8M尿素或6M鹽酸胍處理，使亞基分開。對於鏈內或鏈間二硫鍵可用過量的β基乙醇使之還原，並用烷基化試劑保護以防重新氧化。③測定多肽鏈的胺基酸組成。用於蛋白質的胺基酸組成測定的水解方法主要是酸水解。分離胺基酸混合物經常使用強酸型陽離子交換樹脂，目前已有全自動的胺基酸分析儀可進行此項工作。④分析多肽鏈的N—末端和C—末端殘基，以便建立兩個重要的胺基酸順序參考點。測定N—末端殘基的常用方法是二硝基氟苯(DNFB)法和丹磺醯氯(DNS)法，它們與多肽或蛋白質的游離末端—NH2反應，經酸水解得到N—末端胺基酸的DNP—或DNS—衍生物，可用紙層析、薄層層析或高效液相色譜進行分離鑑定和定量測定。C—末端殘基測定常用方法有肼解法和還原法。⑤用兩種或幾種不同的斷裂方式，將多肽樣品降解成兩套或幾套肽段。測定各個肽段的胺基酸順序，並利用幾套肽段的胺基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的胺基酸順序。肽鏈的降解多用胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等專一性強的蛋白水解酶或溴化氰等化學試劑進行有控制的裂解。肽段的胺基酸順序測定主要使用特殊的化學降解法，此外還有酶解法、氣象色譜—質譜聯用法等。⑥對蛋白質分子內的二硫鍵進行定位，用胃蛋白酶水解含二硫鍵的蛋白質，電泳分離肽段，然後用過甲酸蒸汽使—S—S—斷裂。在相同的條件下進行第二向電泳，則原來的“I”字肽將偏離對角線，用這種方法可測定出二硫鍵在原肽鏈內和肽鏈間的位置。