概述
DNA測序（DNA sequencing）作為一種重要的實驗技術，在生物學研究中有著廣泛的套用。早在DNA雙螺旋結構（Watson and Crick,1953)被發現後不久就有人報導過DNA測序技術，但是當時的操作流程複雜，沒能形成規模。隨後在1977年Sanger發明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert發明了化學降解法。Sanger法因為既簡便又快速，並經過後續的不斷改良，成為了迄今為止DNA測序的主流。然而隨著科學的發展，傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術，第二代測序技術（Next-generation sequencing)應運而生。這三個技術平台各有優點，454 FLX的測序片段比較長，高質量的讀長（read）能達到400bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比其他兩種低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準確度高，原始鹼基數據的準確度大於99.94%，而在15X覆蓋率時的準確度可以達到99.999%，是目前第二代測序技術中準確度最高的。雖然第二代測序技術的工作一般都由專業的商業公司來完成，但是了解測序原理、操作流程等會對後續的數據分析有很重要的作用，下文將以Illumina/Solexa Genome Analyzer 測序為例，簡述第二代測序技術的基本原理、操作流程等方面。
基本原理
Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的螢光標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會釋放出不同的螢光，根據捕捉的螢光信號並經過特定的計算機軟體處理，從而獲得待測DNA的序列信息。
操作流程
1）測序文庫的構建（Library Construction）
首先準備基因組（雖然測序公司要求樣品量要達到200ng，但是Gnome Analyzer系統所需的樣品量可低至100ng,能套用在很多樣品有限的實驗中），然後將DNA隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段，並在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）。如果是轉錄組測序，則文庫的構建要相對麻煩些，RNA片段化之後需反轉成cDNA，然後加上接頭，或者先將RNA反轉成cDNA，然後再片段化並加上接頭。片段的大小（Insert size）對於後面的數據分析有影響，可根據需要來選擇。對於基因組測序來說，通常會選擇幾種不同的insert size，以便在組裝（Assembly）的時候獲得更多的信息。
2）錨定橋接（Surface Attachment and Bridge Amplification）
Solexa測序的反應在叫做flow cell的玻璃管中進行，flow cell又被細分成8個Lane，每個Lane的內表面有無數的被固定的單連結頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供後續的預擴增使用。
3）預擴增（Denaturation and Complete Amplification）
添加未標記的dNTP 和普通Taq 酶進行固相橋式PCR 擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環，將會在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。
4）單鹼基延伸測序（Single Base Extension and Sequencing）
在測序的flow cell中加入四種螢光標記的dNTP 、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互補鏈時，每加入一個被螢光標記的dNTP就能釋放出相對應的螢光，測序儀通過捕獲螢光信號，並通過計算機軟體將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。從螢光信號獲取待測片段的序列信息的過程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的軟體是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。讀長會受到多個引起信號衰減的因素所影響，如螢光標記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯誤率也會隨之上升。
5）數據分析（Data Analyzing）
這一步嚴格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數據是長度只有幾十個鹼基的序列，要通過生物信息學工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，並進一步分析得到有生物學意義的結果。
