毛細管電泳法

毛細管電泳法

毛細管電泳: 是以彈性石英毛細管為分離通道,以高壓直流電場為驅動力,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的電泳分離分析方法。

基本信息

毛細管電泳

所用設備

主要部件有0~30kV可調穩壓穩流電源,內徑小於100μm(常用50~75μm)、長度一般為30~100cm的石英毛細管、電極槽、檢測器和進樣裝置。檢測器有紫外/可見分光檢測器、雷射誘導螢光檢測器和電化學檢測器,前者最為常用。進樣方法有電動法(電遷移)、壓力法(正壓力、負壓力)和虹吸法。成套儀器還配有自動沖洗、自動進樣、溫度控制、數據採集和處理等部件。

毛細管電泳所用的石英毛細管柱,在pH值>3的情況下,其內表面帶負電,與緩衝液接觸時形成雙電層,在高壓電場作用下,形成雙電層一側的緩衝液由於帶正電而向負極方向移動,從而形成電滲流。同時,在緩衝溶液中,帶電粒子在電場作用下,以各自不同速度向其所帶電荷極性相反方向移動,形成電泳。帶電粒子在毛細管緩衝液中的遷移速度等於電泳和電滲流的矢量和。各種粒子由於所帶電荷多少、質量、體積以及形狀不同等因素引起遷移速度不同而實現分離。

毛細管電泳的分離模式

最常見的模式,用以分析帶電溶質。樣品中各個組分因為遷移率不同而分成不同的區帶。為了降低電滲流和吸附現象,可將毛細管內壁做化學修飾。

毛細管凝膠電泳,在毛細管中裝入單體,引發聚合形成凝膠,主要用於測定蛋白質、DNA等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質,如葡聚糖、聚環氧乙烷,裝入毛細管中進行分析,稱毛細管無膠篩分電泳,故有時將此種模式總稱為毛細管篩分電泳,下分為凝膠和無膠篩分兩類。

膠束電動毛細管色譜,在緩衝液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉,形成膠束,被分離物質在水相和膠束相(準固定相)之間發生分配並隨電滲流在毛細管內遷移,達到分離。本模式能用於中性物質的分離。

親和毛細管電泳,在毛細管內壁塗布或在凝膠中加入親和配基,以親和力的不同達到分離目的。

毛細管電色譜,是將HPLC的固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁塗布固定相,以電滲流為流動相驅動力的色譜過程,此模式兼具電泳和液相色譜的分離機制。

毛細管等電聚焦電泳,是通過內壁塗層使電滲流減到最小,再將樣品和兩性電解質混合進樣,兩個電極槽中分別為酸和鹼,加高電壓後,在毛細管內建立了pH梯度,溶質在毛細管中遷移至各自的等電點,形成明顯區帶,聚焦後用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值使溶質通過檢測器。

毛細管等速電泳,採用先導電解質和後繼電解質,使溶質按其電泳倘度不同得以分離。

以上各模式以CZE、CGE、MECE三種套用較多。

對儀器的一般要求

所用的儀器為毛細管電泳儀。正文中凡採用毛細管電泳法測定的品種,其所規定的測定參數,除分析模式、檢測方法(如紫外光吸收或螢光檢測器的波長、電化學檢測器的外加電位等)應按照該品種項下的規定外,其他參數如毛細管內徑、長度、緩衝液的pH值、濃度、改性劑添加量、運行電壓或電流的大小、運行的時間長短、毛細管的溫度等,均可參考該品種項下規定的數據,根據所用儀器的條件和預試驗的結果,進行必要的調整。

電極槽和毛細管內的溶液為緩衝液,可以加入有機溶劑作為改性劑,以及加入表面活性劑,稱作運行緩衝液。運行緩衝液使用前應脫氣。電泳譜中各成分的出峰時間稱遷移時間。膠束電動毛細管色譜中的膠束相當於液相色譜的固定相,但它在毛細管內隨電滲流遷移,故容量因子為無窮大的成分最終也隨膠束流出。其他各種參數都與液相色譜所用的相同。

檢測方法

毛細管電泳通常用到的檢測方法有吸收光譜,螢光光譜,熱鏡,拉曼光譜,質譜和電化學方法。

高速毛細管電泳(CE)分離系統

晶片的高效高速毛細管電泳(CE)分離系統

近年來該技術發展迅速,在蛋白質、脫氧核糖核酸(DNA)等生物大分子的分離分析中表現出了顯著的優越性。20世紀90年代初,Manz和Widmer等首次提出了以微機電加工技術(microelectromechanical systems,MEMS)和分析化學為基礎的微全分析系統(miniaturized total analysis systems,mTAS)的概念。 當前,隨著蛋白質組研究的深入和發展,如何實現蛋白質快速高效的分離成為需要解決的重要問題。在晶片上進行蛋白質的毛細管電泳分離可以顯著地提高分析速度和分離效率,因此,這一研究方向引起了廣泛關注,已有較多論文發表。

微流控晶片毛細管電泳的特點

晶片毛細管電泳技術將常規的毛細管電泳操作在晶片上進行,利用玻璃、石英或各種聚合物材料加工微米級通道,以高壓直流電場為驅動力,對樣品進行進樣、分離及檢測。它與常規毛細管電泳的分離原理相同,因此在分離生物大分子樣品方面具有優勢。此外,與常規毛細管電泳系統相比,晶片毛細管電泳系統還具備分離時間短、分離效率高、系統體積小且易實現不同操作單元的集成等優點。晶片毛細管電泳的上述優點使其成為蛋白質分離分析中的重要手段之一。Rodriguez等曾分別在常規毛細管、短毛細管和玻璃晶片上,以區帶電泳的分離模式,對人免疫球蛋白G(IgG)和螢光素異硫氰酸酯(FITC)的反應混合物進行分離,以比較3種系統的分離性能。使用有效分離長度為35 am的長毛細管和有效分離長度為6 am的短毛細管時,其分離時間分別為335 S和84 S,理論塔板數分別為27 750和41 816。當使用有效分離長度僅為2.8 cm的玻璃晶片時,分離時間縮短至15 S,理論塔板數達到49 000。由此可以看出採用玻璃晶片進行毛細管區帶電泳在分離速度和柱效上明顯優於常規毛細管電泳系統。

微流控晶片毛細管電泳分離蛋白質的模式

目前,文獻報導的晶片毛細管電泳分離蛋白質主要採用區帶電泳、凝膠電泳、等電聚焦、膠束電動色譜及二維電泳等模式。

晶片毛細管區帶電泳

毛細管區帶電泳是晶片毛細管電泳分離蛋白質的一種最基本的分離模式。它基於不同的蛋白質分子在電場中的遷移速率不同而實現分離,是一種簡單、快速的分離方法。採用區帶電泳分離模式已成功地分離了多種蛋白質樣品。

Colyer等採用毛細管電泳晶片,以區帶電泳模式對人血清蛋白樣品進行了分離,可分辨出4個蛋白質區帶(即IgG、轉鐵蛋白、a-1-抗胰蛋白酶和白蛋白區帶,分別用以模擬血清蛋白樣品中的7、p、dl和白蛋白區帶)。其中蛋白質的螢光標記在分離之後進行,由於螢光染料TNS(2-toluidinonaphtha.1-ene-5-sulfonate)標記血清蛋白的靈敏度較低,所以沒能實現實際人血清蛋白樣品的5個區帶分離。Xiao等採用區帶電泳模式,以50 mmoVL磷酸鹽緩衝液(pH 2.15)作為工作緩衝液,在通道寬度為30um的聚二甲基矽氧烷(PDMS)晶片中,於35s內實現了細胞色素C和溶菌酶的快速分離。Dodge等設計了集成8個微閥和1個微泵的PDMS晶片,通過微閥微泵實現了對液流的有效控制。他們首先採用區帶電泳的分離模式分離牛血清白蛋白和肌紅蛋白,然後通過閥的作用將分離後的蛋白質組分分別引入微混合器中酶解,最後對產物進行質譜分析。該工作顯示晶片技術可用於質譜分析前複雜蛋白樣品的預處理。莊等在石英晶片上以75 mmol/L硼酸鹽緩衝液(pH 10.3)作為晶片電泳緩衝體系,分離了免疫球蛋白、O/一1一抗胰蛋白酶、牛血清白蛋白和鐵傳遞蛋白,並對經臨床確診的妊娠高血壓症、風濕性心臟病、多發性骨髓瘤患者的尿液樣品進行電泳分析,在2 min內得到了與美國Helena電泳系統一致的分析結果。

在晶片毛細管電泳分離蛋白質的研究中所要解決的一個重要問題就是通道表面對大分子蛋白質的吸附問題。蛋白質與晶片通道內壁之問的微小吸附效應就會降低蛋白質的分離效率,引起峰形變寬拖尾,影響分離的重現性。在毛細管區帶電泳分離模式下,一般採用通道內壁永久改性和緩衝液中加入添加劑進行動態修飾兩種方法來抑制蛋白質的吸附。

Wu等採用多層88%水解聚丙烯醇(PVA)修飾PDMS晶片,以區帶電泳模式有效分離了兩種鹼性蛋白質(溶菌酶和核糖核酸酶)以及兩種典型的酸性蛋白質(牛血清白蛋白和口.乳球蛋白)。該塗層在pH 3~11範圍內均可抑制電滲流的產生和蛋白的吸附作用,並且效果穩定,連續運行70次後分離效果仍然很好。該研究組隨後又採用自組裝方法在PDMS晶片通道表面加工環氧修飾的聚合物塗層抑制蛋白質的吸附,成功地分離了溶菌酶和核糖核酸酶A。Chiem等在運行緩衝液中加入了無機電解質NaCl和中性表面活性劑吐溫20來抑制蛋白質的吸附,利用晶片毛細管區帶電泳進行了單克隆抗體的分離分析。 ‘

晶片毛細管凝膠電泳

在蛋白質組學和蛋白質分離研究中,凝膠電泳是廣泛使用的分離技術。它是以凝膠等聚合物作為分離介質,利用其網路結構並依據被測組分的分子體積不同而進行分離的一種分離模式。在晶片上採用凝膠電泳模式分離蛋白質,更有利於實現分離操作的高速度和高效率。Yao等採用十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳分離模式,對比了晶片SDS毛細管凝膠電泳與常規毛細管凝膠電泳系統分離蛋白質的性能,結果表明前者的分離效率明顯優於後者,分離時間也明顯低於後者。

與常規毛細管凝膠電泳相同,晶片毛細管凝膠電泳常用的篩分介質也分為凝膠和非膠聚合物溶液兩種。交聯聚丙烯醯胺凝膠是廣泛使用的一種凝膠篩分介質,Herr等首次將傳統的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS·PAGE)分離蛋白質的方法移植到晶片上,採用光聚合的方法在晶片通道內製備濃度為6%的交聯聚丙烯醯胺凝膠作為篩分介質,在30S的時間內對相對分子質量(M,)在5 500~39 000之問的5種蛋白質進行分離,分離距離僅為4 mm,分離效率達到理論塔板數4.41×105。該研究組’1引後期又在微通道內製備了濃度為22%的交聯聚丙烯醯胺膜用於蛋白質樣品的預富集,有效富集了相對分子質量為12 000~205 000的蛋白質分子,並採用濃度為8%的交聯聚丙烯醯胺凝膠作為篩分介質進行分離。

Agirregabiria等在聚甲基丙烯酸甲酯(PM—MA)晶片上使用SU一8光膠製作微通道,採用濃度為12%的聚丙烯醯胺凝膠作為篩分介質分離蛋白質。隨後該研究組又在該晶片上集成金屬電極,採用相同的分離模式成功地分離了相對分子質量分別為20 000和97 000的胰蛋白酶抑制劑和磷酸化酶兩種蛋白質。然而,交聯聚阿烯醯胺凝膠存在製備複雜、不易使用等問題。與其相比,線性聚丙烯醯胺(PLA)、聚乙烯醇(PEG)、聚氧化乙烯(PEO)等非膠篩分介質具有製備簡單、使用方便、可以先聚合後注入通道而無需在通道內進行聚合反應等優點,適合在複雜的通道體系中使用,因此在晶片毛細管凝膠電泳中非膠篩分介質得到了廣泛的套用。Yao等採用SDS 14·200凝膠緩衝液(Beckman Coulter公司產品)在玻璃晶片上於35 s內分離了相對分子質量在9 000~l 16 000之間的6種蛋白質。Giordano等將NanoOrange染料加入樣品和緩衝液中進行蛋白質的動態標記,並對分離緩衝液體系進行了最佳化,最終選擇5%的PEO(M,=100 000)作為篩分介質。該系統對牛血清白蛋白的檢出限為500ng/mL,並完成了對實際人血清樣品的分離分析。

在晶片毛細管凝膠電泳中,通道內壁對蛋白質的吸附仍是需要解決的重要問題。Bousse等使用聚二甲基丙烯醯胺(PDMA)物理塗覆玻璃晶片微通道內壁,將電滲流降低到0.5×10~m zV s .以SDS凝膠電泳的分離模式在40 s內分離了Bio—Rad公司的蛋白質標準樣品’,分離效率達到107塔板/m。Nagata等在PMMA晶片中使用了PEG塗層,以5%線性聚丙烯醯胺為篩分介質,在分離長度為3 mm的通道內實現了胰蛋白酶抑制劑、牛血清白蛋白和盧半乳糖苷酶3種蛋白質的高速分離,分離時間僅為8 S 。

晶片等電聚焦分離

晶片等電聚焦分離蛋白質的原理與常規毛細管等電聚焦基本相同,都是依據蛋白質的等電點(pI)不同而進行分離。Hofmann等首次將毛細管等套用於蛋白質分析。

Li等在PDMS晶片和聚碳酸酯(PC)晶片上,採用等電聚焦模式分離廠牛血清白蛋白和增強型綠色螢光蛋白(EGFP)。Das等。26 3採用高聚物晶片,在等電聚焦電泳模式下最佳化了,分離長度及電壓條件,最終在長1.9 cm的通道內於1.5 min內分離了綠螢光蛋白和R藻紅蛋白,分離電壓為500 V。Cui等在PDMS晶片上採用等電聚焦分離模式成功分離了組綠螢光蛋白、異藻青蛋白和藻紅蛋白。該作者還報導,通過改變樣品和分離介質中添加劑甲基纖維素的濃度,可以改變完成蛋白質分離所需要的通道距離,Tsai等通過採用六甲基二矽氧烷等離子聚合膜修飾玻璃晶片通道的方法抑制蛋白質吸附,在等電聚焦的分離模式下分離了藻青蛋白(pI:4·65)、血紅蛋白(pI: 7.0)和細胞色素C(pI:9·6)3種蛋白質混合物,分離在3 min內完成,分離效率為19 600塔板/m。Huang等在進行晶片等電聚焦分離蛋白質時,採用在兩性電解質溶液中加入羥甲基纖維素作為添加劑的方法來抑制蛋白質的吸附。

晶片膠束電動毛細管電泳

膠束電動毛細管電泳是毛細管電泳與膠束增溶色譜相結合的分離技術,其原理是在裝有膠束溶液的通道內,溶質組分在電場力的作用下根據其在膠束相和水相之問的分配不同而產生分離。Jin等在玻璃晶片上採用膠束電動色譜的分離模式,以Bio-Rad公司的CE·SDS緩衝液作為分離介質,成功實現了相對分子質量在14 400~200 000之間的8種蛋白質的分離。Dou等採用Brij35(polyoxyethylene[23]dodecan01)修飾PDMS晶片通道,在膠束電動色譜的分離模式下實現了葡萄糖氧化酶和肌紅蛋白的有效分離。該晶片塗層在pH 2~6範圍內可顯著降低蛋白質大分子的吸附,並減少檢測蛋白質所需的沖洗時間,從而提高分離效率。Huang等在PDMS晶片中採用0.1%十二烷基麥芽糖(DDM)和0.03%SDS作為混合膠束,對通道進行動態修飾,有效地抑制了蛋白質的吸附,控制了電滲流,使蛋白質在非變性條件下得到有效分離.

晶片二維電泳分離

晶片毛細管電泳套用的成功促進了高速高效的晶片二維電泳技術的發展。對於多組分的複雜蛋白質樣品,採用傳統的一維分離方法通常無法滿足要求,需要採用二維分離技術來提高分離效率,增加峰容量。與傳統的毛細管電泳系統相比,在晶片上進行二維電泳分離,可以通過設計晶片通道結構實現通道的直接交叉或連通,而無需製作複雜的二維毛細管電泳接口,從而避免了因在接口處存在死體積而導致的譜帶擴展現象。

在晶片二維電泳分離蛋白質的研究中,第一維分離模式多採用等電聚焦模式。Chen等製作了二維毛細管電泳PDMS晶片,利用第一維的等電聚焦和第二維的凝膠電泳對螢光標記的牛血清白蛋白和碳酸酐酶以及德科薩斯紅標記的卵清蛋白進行分離分析。Li等設計了等電聚焦和凝膠電泳聯用的二維分離高聚物心4t-片。蛋白質樣品在完成第一維的等電聚焦分離後,可在多個並行的通道內完成第二維的凝膠電泳分離。整個分離過程在10 min內完成,峰容量達到1 700。Herr等:”1研製r採用十字通道構型的等電聚焦一自由區帶電泳二維晶片系統,晶片通道寬200斗m,深20斗m,待測樣品在橫向通道中進行等電聚焦分離,分離後的樣品區帶在電場驅動下進入縱向區帶電泳通道中進行第二維分離。系統採用螢光顯微鏡成像的方法對分離性能進行了評價,5 min內分離的峰容量達到1 300。Wang等通過在PDMS晶片中製作微閥來防止一維等電聚焦和二維凝膠電泳系統之間的分離緩衝液相混合,在20 rain內有效分離了4種標準蛋白質。也有報導在PMMA晶片上進行SDS凝膠電泳和膠束電動毛細管電泳相結合的蛋白質二維電泳分離。該系統在12 min內完成10種蛋白質的分離,峰容量約為l 000。

此外,還有一類基於晶片的二維分離系統主要套用於蛋白質酶解物的分離分析。通常第一維分離採用膠束電動毛細管電泳或毛細管電色譜模式,第二維分離採用區帶電泳模式2000年,Ramsey課題組。“1首次在玻璃晶片上建立了膠束電動毛細管電泳(第一維)與區帶電泳(第二維)結合的二維分離系統,並套用於細胞色素C、核糖核酸酶、d哥L白蛋白等的胰蛋白酶降解產物分離。其後,該課題組對系統進行了改進,加長了第一維電泳通道的長度,並採用細徑轉角通道來降低擴散,在約15 min內分離了牛血清白蛋白酶解物,峰容量達到4 200。2001年,他們還研製了開管電色譜和區帶電泳相結合的晶片二維電泳系統,其電色譜分離部分採用長25 cm的具有十八烷基三甲氧基矽烷塗層的環狀通道,區帶電泳部分則採用長1.2 am的直形通道,在13 min內實現了屆一酪蛋白胰蛋白酶解產物的分離。

相對於一維分離晶片,二維晶片分離系統具有很高的分離效率和峰容量,預計會在複雜蛋白質樣品的分離上發揮更大的作用。

晶片自由流電泳

除上述分離模式外,晶片自由流電泳也是晶片電泳分離蛋白質的重要方法。晶片自由流電泳是指在晶片中通過外加電場使樣品隨緩衝液連續流動的同時沿電場方向進行電遷移,從而按照電泳淌度不同實現分離的電泳分離模式。Raymond等採用晶片自由流電泳模式分離了人血清蛋白、緩激肽和核糖核酸酶A,其分離長度為3.1 cm,流出時間為62 S。Kobayashi等採用自由流電泳的分離模式在一個體積為56.5 mm×35 mm×30 mm的微分離室(60uL)中實現了持續的蛋白質分離,並用羥丙基甲基纖維素塗覆來抑制蛋白質吸附,在25 min內有效分離了細胞色素C和肌紅蛋白。最近,Kohl.heyer等H 3。製作了一種自由流等電聚焦分離蛋白質的玻璃晶片,成功地將人血清白蛋白(pI=4.4)與等電聚焦標記物(pH 3和9)分離。

展望

微流控晶片毛細管電泳系統套用於蛋白質的分離分析具有突出的優越性,特別是在臨床檢驗及現場監測等方面的套用具有良好的發展前景,同時,其對分析儀器的集成化、微型化與便攜化的發展也具有重要意義。據文獻報導,Renzi等已經研製出手持式的微流控晶片電泳分離蛋白質裝置。該裝置由電泳晶片、小型雷射誘導螢光檢測系統以及高壓電源等組成,其體積僅為11.5 cm×11.5 cm×19.0 cm,可用於現場分析、床旁醫學診斷以及取證分析。近年來,國內已有關於利用晶片毛細管電泳進行臨床尿蛋白和脂蛋白檢測的報導。最近,Pandey等”川使用Caliper公司和Agilent公司的P200蛋白質晶片來檢測微量的白蛋白尿,將蛋白質的電泳分離和螢光檢測集成化、自動化,實現了其在臨床實驗室的套用。

目前,很多科研工作者正致力於微流控晶片毛細管電泳與質譜聯用技術的研究,以進一步提高系統對複雜樣品的分離分析能力。上述系統在蛋白質分離分析及蛋白質組研究中有廣闊的套用前景。尤其是對於複雜蛋白質樣品的多維分離分析,晶片毛細管電泳以其快速高效的特點,可以作為其中的一維分離方法,顯著提高蛋白質的分析通量。相信隨著研究的不斷深入及相關技術的不斷發展,微流控晶片毛細管電泳蛋白質分離技術將日趨成熟,在生化分析、臨床診斷和蛋白質組研究領域發揮重要的作用

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