單鏈構象多態性分析

單鏈構象多態性分析

單鏈構象多態性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是利用DNA或RNA單鏈構象具有多態性的特點,結合PCR技術進行基因檢測的一種分析技術,稱為PCR-SSCP技術,用以分析微生物的遺傳學特徵和基因突變。由於毛細血管電泳技術能在數十分鐘內將PCR擴增片斷分離出雙鏈及單鏈峰,僅有一個鹼基差異的兩條DNA也能得到較好的分離,說明毛細血管電泳技術用於PCR-CE-SSCP是一種快速、有效的篩選基因點突變的方法。採用細菌rRNA基因(16SrRNA 23SrRNA)分析,對微生物進行分類鑑定,對絕大多數血培養陽性分離株及分支桿菌屬細菌的鑑定,均顯示出良好的分辨效果。而且對結核分支桿菌的各種耐藥基因檢測,對喹諾酮類藥物耐藥決定區基因突變的檢測已成為常用的方法。如用限制性內切酶水解PCR片斷,還可進行限制性片斷長度多態性分析,PCR-CE-SSCP技術在微生物分類、新種類鑑定、分子流行病學調查中均具有重要作用。

分析原理

聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年來發展起來的一種基因分析方法。
PCR-SSCP分析的基本程式為:首先PCR擴增特定靶序列,然後將擴增產物變性為單鏈,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯醯胺凝膠中電泳時,DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外,更主要的是取決於DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下,DNA單鏈可自身摺疊形成具有一定空間結構的構象。這種構象由DNA單鏈鹼基決定,其穩定性靠分子內局部順序的相互作用(主要為氫鍵)來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同,甚至單個鹼基不同,所形成的構象不同,電泳遷移率也不同。PCR產物變性後,單鏈產物經中性聚丙烯醯胺凝膠電泳,靶DNA中含單鹼基置換,或數個鹼基插入或缺失等改變時,因遷移率變化會出現泳動變位,從而可將變異DNA與正常DNA區分開。由此可見,PCR-SSCP分析技術是一種DNA單鏈凝膠電泳技術,它根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯醯胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術已被廣泛用於癌基因和抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因製圖等領域。

適用領域

為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結果,現已發展多種PCR-SSCP技術,各有其優勢及適用領域。例如,可以在PCR擴增中用同位素或螢光素等標記引物或核苷,也可以在電泳後用銀染或溴化乙錠染色以顯示結果。這裡將重點介紹最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在進行PCR擴增特定靶基因序列時,利用γ-32P-ATP標記引物或直接在PCR反應體系中加入α-32P-dCTP進行PCR擴增,使擴增產物帶有同位素標記物,然後將擴增產物變性為單鏈進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,放射自顯影顯示結果。利用引物標記或鹼基摻入法使PCR擴增產物帶有同位素標記物,均可使產物信號增強幾個數量級。二者相比較,前者經濟、擴增特異性強,多用於大樣本的檢測和篩選;後者操作簡便,適於一般實驗室開展,可用於小樣本或大樣本的檢測和篩查。

鹼基摻入法

試劑準備

⒈ PCR相關試劑
⒉ α-32P-dCTP
⒊ 30%聚丙烯醯胺(29:1):丙烯醯胺29g、甲叉雙丙烯醯胺1g,溶於100ml ddH2O中,4 OC保存。
⒋ 10%過硫酸胺配製方法:1g 過硫酸胺,溶於10ml ddH2O中,4 OC保存(可用數周)。
⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
⒍ 5×TBE緩衝液:Tris鹼54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。
7.變性上樣液:95%甲醯胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚藍、 20mM EDTA(pH 8.0)

操作步驟

⒈ PCR擴增

反應總體積為10μl,在0.5ml微量離心管中加入下列反應成分:
10×buffer   1μl
dNTPmix   70μM
DNA模板 100ng
引物及TaqDNA酶依實驗設計要求按比例加入
α-32P-dCTP   0.1μl
加ddH2O至   10μl
按實驗設計循環參數進行擴增,獲取擴增產物。

⒉ 聚丙烯醯胺凝膠電泳
⑴電泳槽玻璃板的處理:用洗滌劑清洗玻璃板,自來水反覆沖淨洗滌劑,雙蒸水沖洗3次,晾乾,95%乙醇擦拭,自然乾燥。用棉簽沾取SigmaCote塗於玻璃的貼膠面上, 5~10min後再用軟紙擦拭除去多餘的SigmaCote溶液。在兩塊玻璃內的兩側放好襯條對齊,用固定夾夾緊兩塊玻璃,並用玻璃膠帶封邊。
⑵ 制膠:按照被分離DNA片段的大小、含量及玻璃板、襯條的大小決定凝膠的濃度與體積,一般來講使用5%~8%的凝膠較為合適。輕輕搖勻配製的膠液於真空抽氣(開始時要緩慢)除氣泡,加 35μl TEMED至聚丙烯醯胺混合液中,混勻。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取膠液,將玻璃模具傾斜成60O角,緩慢注入兩玻璃板間的空隙中,直至灌滿模具頂部。立即插入相應的點樣梳,(小心勿使梳齒下帶進氣泡,並且不要將梳齒全部插入膠內,留約2mm梳齒於玻璃板上端,以免拔梳時把膠孔拔斷)。由於凝膠在聚合過程中有回縮,所以應小心添加些膠液於梳子處,水平放置,室溫聚合1hr。將封口玻璃膠帶掀去,放入電泳槽,凹型玻璃貼緊電泳緩衝液槽,用大號固定夾固定住兩側。在上下電泳槽內灌入 1×TBE電泳緩衝液。小心取出點樣梳,用槽內的緩衝液反覆沖洗點樣孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和氣泡。
⑶ 擴增產物的處理:將PCR擴增產物與變性上樣液按1:5的比例加入0.5ml 微量離心管中,混勻。樣品上膠前應98 o C變性10min,立即冰浴驟冷。取約3~5μl變性樣品(根據點樣孔的大小決定上樣量),以微量加樣器上樣,(上樣時要注意不要有氣泡衝散樣品,而且速度要快,時間長了樣品易於擴散)。
⑷ 電泳:電泳槽接上電極(上槽接負極,下槽接正極)開啟電源,根據擴增片段的大小及電泳槽和凝膠的大小,決定電泳的電壓及電泳時間。通常室溫下以l~5V/cm電泳。
⑸ 剝膠:電泳結束後,倒棄電泳緩衝液,取下電泳膠玻璃,用塑膠楔子從玻璃板底部一角小心分開玻璃,凝膠應附著在一塊玻璃上,切去凝膠左上角,作為點樣順序標記。剪一張與玻璃同樣大小的濾紙,嚴密覆蓋於凝膠上,順一個方向將凝膠緩慢取下,用保鮮膜蓋於膠面並包好,避免膜和膠之間產生氣泡或皺摺,將凝膠固定在X線片夾中。
⑹放射自顯影:在暗室中將X線片貼於膠面,蓋嚴片夾,用黑布將X線片夾包裹,置-70OC放射自顯影。曝光時間根據同位素的強度而定,約 24h~10d。
⑺ 沖洗膠片從-70oC取出X線片夾,在暗室內迅速取出X線片,立即顯影,以免使X線片上出現過多的冷凝水。(如果想再得到一張放射自顯影影像,可立即在片夾中裝一張新X線片並儘快放回到一70oC繼續顯影。如果來不及再加入新片即已出現冷凝水則應使樣品凝膠和X線片夾都恢復到室溫,並擦去冷凝水後再裝入新的X線片)。依次按以下程式操作進行顯影:
X線片顯影液顯影 1-5min
水洗 lmin
定影液定影 5min
流動水沖洗 15min
所有使用液的溫度應為18~20OC為宜。

注意事項

⒈核酸片段的大小: 用於SSCP分析的核酸片段越小,檢測的敏感性越高。對於<200bp的片段,SSCP可發現其中70%的變異;對於300bP左右的片段則只能發現其中50%的變異;而>500bp的片段,則僅能檢出10%~3O%的變異,因此,<300bP,尤其是150bP左右的核酸片段更適於SSCP分析。對於大於400bp的PCR產物就需要設法進一步處理,可以用限制性酶消化PCR產物,產生小於400bP的DNA片段,再進行SSCP分析。
⒉ 游離引物: 游離引物可能同 PCR產物結合而改變其泳動率,即使游離引物量為6nM都有明顯影響。因此,應儘可能除去游離引物。可以採用不對稱引物擴增方法,儘可能消耗多餘的引物。也可以運用過柱或磁性球方法純化PCR產物。或者是稀釋PCR產物,減少游離引物的干擾。
⒊ 低濃度變性劑: 凝膠中加入低濃度的變性劑,如5%-10%甘油、5%尿素或甲酸胺、10%二甲亞碸(DMSO)或蔗糖等有助於提高敏感性,可能是因為輕微改變單鏈DNA的構象,增加分子的表面積,降低單鏈DNA的泳動率。但有些變異序列卻只能在沒有甘油的凝膠中被檢出。因此,對同一序列使用2~3種條件做SSCP,可能提高敏感性。
⒋ 電泳溫度: 一般認為保持凝膠內溫度恆定是SSCP分析最關鍵的因素,溫度有可能直接影響DNA分子內部穩定力的形成及其所決定的單鏈構象,從而影響突變的檢出。室溫下電泳適於大多數情況,但由於在電泳時溫度會升高,為確保電泳溫度相對恆定,應採取以下措施:減少凝膠厚度,降低電壓,有效的空氣冷卻或循環水冷卻等。
⒌ 凝膠的長度: 可用測序板進行SSCP分析,凝膠板長度在40cm以上。
⒍ 凝膠濃度及厚度: 凝膠濃度很重要,一般使用5%~8%的凝膠,凝膠濃度不同,突變帶的相對位置也不相同,如果在進行未知突變種類的SSCP分析時,最好採用兩種以上凝膠濃度,這樣可以提高突變種類的檢出率。凝膠的厚度對SSCP分析也很重要,凝膠越厚,背景越深,在上樣量較多的前提下,儘量使凝膠越薄越好。
⒎假陰性: 一般認為,如沒有污染,PCR-SSCP分析不存在假陽性結果,但可能出現假陰性結果,後者是由於點突變引起的空間構象變化甚微,遷移率相差無幾所致,尤其是點突變發生在擴增片段的兩端時。如果有陽性和陰性對照,結果可以重複確定的突變帶是可信的,如果沒有陽性對照,應經測序來確定其是否為突變帶。由於PCR-SSCP的不足之處主要是可能檢出假陰性結果。應通過設定陽性對照,摸索電泳條件,假陰性結果在很大程度上是可以避免的。但對未知基因變異的檢測,假陰性結果就難以百分之百地消除。
8. 結果分析: 單鏈凝膠電泳時,互補單鏈遷移率不同,一般形成兩條單鏈帶。PCR產物進行單鏈凝膠電泳之前,通過加熱變性產生單鏈。如變性不徹底,殘留雙鏈亦可形成一條帶.因此,PCR-SSCP分析結果至少顯示三條帶。但是,由於一種DNA單鏈有時可形成兩種或多種構象,檢出三條或四條單鏈帶就不足為奇。

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